Project

Modellering van de degeneratieve adaptatie van de microcirculatie en perfusie van de cirrotische lever

Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Engineering and technology
    • Other engineering and technology
Trefwoorden
Cirrotische lever leverfalen hermodellatie bloedvaten
 
Projectomschrijving

De lever is een belangrijk orgaan dat allerlei vitale functies uitvoert om de lichaamshomeostase te handhaven (bijv. vorming van gal en cholesterol, detoxiťcatie van gi.ige sto.en en de synthese van eiwitten). Het is een uniek orgaan in de zin dat de lever als enigste kan regenereren na weefselschade. Indien het leverweefsel echter aanhoudend verwoest wordt, zal de lever evolueren naar cirrose.

Cirrose is een schadelijke leveraandoening die vaak wordt toegeschreven aan een ongezonde levensstijl, zoals overmatig alcoholgebruik of consumptie van vetrijk voedsel. De aandoening wordt gekenmerkt door ernstige beschadiging van het leverweefsel met een aantasting van zowel de leverperfusie als -functie. Van zodra cirrose de gedecompenseerde fase bereikt, kan het nog functionerende deel van de lever onvoldoende compenseren voor het aangetaste deel en worden complicaties klinisch zichtbaar. In geval van vergevorderde cirrose kan acuut leverfalen of een verdere evolutie naar leverkanker optreden. Cirrose is de twaalfde doodsoorzaak ter wereldmet een sterftecijfer dat in óþÕþ een miljoen overschreed. Momenteel wordt cirrose nog steeds beschouwd als een onomkeerbare aandoening waardoor de behandeling voornamelijk gericht is op het vertragen van het ziekteproces en het verminderen van de complicaties. Bij vergevorderde stadia van cirrose blij. een levertransplantatie de enige therapeutische mogelijkheid. In dit geval kan de lever zijn functies niet meer naar behoren uitvoeren en zullen levensbedreigende complicaties opduiken. Een nauwkeurige opvolging en inschatting van de lever(functie) bij cirrose is dus essentieel om de behandeling af te stemmen op de vereisten van de patiënt. Tot op heden is een dergelijke patiëntgerichte aanpak nog niet mogelijk wegens een gebrek aan kennis over de pathogenese van cirrose. In dit doctoraat focussen we op één aspect van cirrose, zijnde de bloedvaten en hoe deze hermodelleren doorheen het ziekteproces. Deze adaptatie van de levervasculatuur vormt een sleutelfactor bij het ontstaan van cirrose. De ermee gepaard gaande verstoring van de leverperfusie is echter nog onvoldoende gekend. De belangrijkste doelstelling van dit werk is dan ook de aanpassing van de vasculatuur van de lever doorheen de ontwikkeling van cirrose te documenteren en analyseren, enerzijds in relatie tot de aangetaste architectuur en anderzijds in relatie tot de verminderde perfusie van de lever. Dit proefschri. is onderverdeeld in drie delen waarvan deel I een uitgebreid overzicht gee. van de lever en cirrose. In deel II wordt dieper ingegaan op het onderzoek dat werd uitgevoerd in het kader van dit doctoraat. Tenslotte worden in deel III de belangrijkste bevindingen opgelijst en worden enkele toekomstperspectieven besproken. In dit deel staat de beschrijving van zowel de gezonde als de cirrotische lever centraal. Daarnaast worden ook de technieken die reeds gebruikt werden om cirrose te bestuderen gedetailleerd besproken. Hoofdstuk Õ. De gezonde leverDe lever is een complex en veelzijdig orgaan dat verantwoordelijk is voor meer dan ¢þþmetabolische en ontgi.ende functies (bijv. bloedglucosespiegel regelen). Zijn vasculair systeem is uniek ten opzichte van andere organen omwille van de dubbele bloedtoevoer: de hepatisch arteriële vaatboom voorziet de lever van zuurstofrijk bloed, terwijl de portaal veneuze vaatboom voedingsrijk bloed aanlevert. Beide a.erente vatensystemen lopen parallel doorheen de lever en vertakken herhaaldelijk. Het bloed dat doorheen hun terminale vertakkingen vloeit, wordt vervolgens gemengd in de sinusoïden. Deze laatste zijn leverspeciťeke capillairen die openingen in hun vaatwand (fenestrae) hebben om de moleculaire uitwisseling tussen het bloed en de parenchymale levercellen (hepatocyten) te faciliteren. Het bloed stroomtdoorheen de sinusoïden tot het wordt gecollecteerd in centrale venen die samen met de hepatische venen de afvoer van het bloed uit de lever verzekeren. De hepatische microarchitectuur bestaat uit vijf cellulaire componenten. De hepatocyten zijn de functionele cellen en vertegenwoordigen ongeveer .þÛ van het leverweefsel. De overige cellen (sinusoïdale endotheelcellen, Kup.er cellen, hepatische stellaatcellen en pit cellen) bevinden zich in of vlakbij de sinusoïden. De interactie tussen de verschillende cellen is van vitaal belang om de lichaamshomeostase en fysiologische processen (zoals leverregeneratie) te behouden en reguleren. Anomalieën in de intercellulaire communicatie worden daarom ook steeds vaker geïdentiťceerd als een belangrijke factor bij de totstandkoming van vrijwel elke leverziekte.

Hoofdstuk ó. De cirrotische lever

Cirrose kan worden gezien als het gemeenschappelijke eindpunt van eender welke chronische leverziekte. Het is een pathologische aandoening die ontstaat door aanhoudende vernietiging en regeneratie van het leverweefsel. Dit meedogenloos proces verstoort de hepatische architectuur en tast ook de leverperfusie en -functie aan. Cirrose wordt vaak toegeschreven aan alcoholmisbruik, virale infecties of metabolische syndromen die gerelateerd zijn aan obesitas of diabetes. Deze liggen aan de basis van chronische leverziektes zoals leververvetting of een chronische leverontsteking die verder kunnen evolueren in de richting van cirrose. Gedurende de progressie naar cirrose wordt de normale hepatische architectuur geleidelijk aan vervangen door di.use ťbrose, vasculaire septa en zogenaamde regeneratieve noduli. Deze morfologische kenmerken zijn te wijten aan mechanismen die geactiveerd worden om de hepatocellulaire schade te herstellen. Eén van deze mechanismen is ťbrogenese. Door ťbrose (bindweefsel) te produceren tracht dit mechanisme het beschadigde gebied in te kapselen en te beschermen. De chronische leverziekte leidt echter tot aanhoudende leverschade waardoor abnormale hoeveelheden littekenweefsel worden geproduceerd. Als gevolg hiervan ontwikkelen zich ťbrotische septa tussen de portale triaden en de centrale venen. Deze septa omsluiten bloedvaten die volledig van het functionele leverweefsel worden geïsoleerd. Vervolgens veranderen enkele van deze bloedvaten in bredere shuntvaten. Het bloed dat hier door stroomt, omzeilt de sinusoïden zonder detoxiťcatie en verarmt de hepatocyten van de nodige voedingssto.en. Dit draagt bij tot hepatocellulaire necrose en de ongecontroleerde proliferatie van de overblijvende hepatocyten. Uiteindelijk vormen er zich regeneratieve noduli. Zowel het overmatige littekenweefsel als de regeneratieve noduli drukken de leverbloedvaten samen waardoor de vasculaire weerstand van de lever toeneemt. Daarnaast dragen dynamische veranderingen van de vasculatuur (bijv. actieve vasoconstrictie van de sinusoïden en angiogenese) bij tot de toename van de intrahepatische vasculaire weerstand. Op een bepaald moment overschrijdt de vasculaire weerstand een drempel en treedt er portale hypertensie op. Portale hypertensie is de vroegste enmeest voorkomende complicatie van cirrose en wordt gekenmerkt door een verhoogde bloeddruk in de portaal veneuze vaatboom die ontstaat door obstructie van de bloedstroom. De complicaties die gerelateerd zijn aan cirrose (bijv. ascites en variceale bloedingen) beginnen vaak bij een abnormaal hoge bloeddruk in de leverpoortader. De behandeling van cirrose is daaromgericht op het verlagen van de portaaldruk, het vertragen van de ziekteprogressie en het onderdrukken van complicaties. Bij vergevorderde stadia van cirrose blij. een levertransplantatie echter de enige therapeutische optie. Vroege en nauwkeurige diagnose is bijgevolg noodzakelijk om de progressieve leverziekte te behandelen of om te keren. Dit blij. echter een complex gegevenmede omdat de pathogenese van cirrose nog niet volledig gekend is. Als gevolg hiervan baseren artsen zich nog steeds voornamelijk op hun expertise om de situatie van de lever(functie) en het verder verloop van de leverziekte in te schatten.

Hoofdstuk ì. Technieken om cirrose te modelleren

In de voorbije decennia is er veelvuldig onderzoek naar de pathogenese van cirrose verricht. Dit resulteerde in de ontwikkeling van verschillende modelleringstechnieken. Diermodellen van cirrose (bijv. in muizen, ratten en varkens) gaven onderzoekers de mogelijkheid om het pathologische proces op een gecontroleerde manier te reproduceren en bestuderen. Deze modellen blijven echter een benadering van het humane ziekteproces, aangezien nog geen enkel model ontwikkeld werd dat alle kernmerken/fasen van humane cirrose weerspiegelt. Momenteel worden drie modellen veelvuldig gebruikt om cirrose te induceren in ratten: het tetrachloormethaan-, het galwegligatie- en het thioaceetamide-model. In dit proefschri. kozen we voor het thioaceetamidemodel vanwege zijn betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid. Naast diermodellen werden ook diverse experimentelemethoden ontwikkeld om de hemodynamica en functionele parameters van de lever in vivo te meten. Invasieve methoden, zoals de microbubbels-techniek, werden vooral aangewend om de (micro)hemodynamica in verscheidene diermodellen te kwantiťceren. Niet-invasieve methoden (bijv. intravitale .uorescentiemicroscopie en elastograťe) lieten daarentegen ook toe de morfologische afwijkingen en gewijzigde mechanische eigenschappen van het leverweefsel (bijv. stijfheid) te bepalen. Naast het verscha.en van nieuwe inzichten in cirrose, leenden de experimentele data zich ook tot de ontwikkeling van kwantitatieve mathematische modellen. Wat mathematische modellen betre., vermeldt de literatuur modellen van de adaptieve levervasculatuur, de verstoorde leverperfusie en de verminderde leverfunctie in het geval van cirrose. Twee experimentele technieken, nl. vasculaire afgietsels en immuunhistochemie, werden vaak toegepast om het vertakkingspatroon en de geometrische eigenschappen van de levervasculatuur te kwantiťceren en modelleren. De leverperfusie werd doorgaans onderzocht aan de hand van numerieke vloeistofdynamische modellen en elektrisch analogemodellen. Studies die focusten op leverfunctie, hanteerden een multischaal-benadering om op deze manier biologische processen te integreren in perfusiemodellen. Zodoende werden modellen ontwikkeld om zowel de dynamische leverrespons te voorspellen na leverbeschadiging (bijv. leverregeneratie) als het risico in te schatten op een (langdurig) leverletsel na blootstelling aan schadelijke chemicaliën. Hoewel bepaalde onderdelen van de puzzel werden oplost in deze vroegere studies, is nog steeds meer kwantitatieve informatie nodig omtrent de levervasculatuur op zich, alsook omtrent de perfusie en functie van lever, en dit vooral op microniveau doorheen de verschillende stadia van cirroseontwikkeling. Dit tweede deel omvat eigen origineel onderzoek en beoogt een systematische en kwantitatieve studie van de ziekteprogressie in een gevestigd rattenmodel van cirrose (thioaceetamide), enerzijds in relatie tot de beschadigde levervasculatuur en anderzijds in relatie tot de verminderde leverperfusie.

Hoofdstuk ¦. ìD-reconstructie van de hepatische vasculatuur van ratten

Kennis over de topograťsche organisatie van de levervasculatuur in (cirrotische) ratten was relatief beperkt bij aanvang van dit doctoraat. Bijgevolg werd een methodologisch kader ontwikkeld en geïmplementeerd om de vasculatuur kwantitatief te analyseren en te modelleren over meerdere lengteschalen heen. In dit hoofdstuk worden de methodologie en de optimalisatie hiervan in gezonde rattenlevers uitgebreid beschreven. In het experimentele luik werden twee technieken toegepast om morfologische data van de levervasculatuur te verkrijgen, nl. vasculaire afgietsels en immuunhistochemie. Hoewel beide technieken eerder werden gebruikt om de vasculatuur te bestuderen, vertoonden ze een aantal belangrijke tekortkomingen voor dit werk. Het protocol om afgietsels van de vasculatuur te genereren werd aangepast opdat het mogelijk zou zijn om alle vaatbomen te bekomen van één en dezelfde lever. Daarnaast werd het immuunhistochemieprotocol uitgebreid met een aangepaste klaringstechniek (CUBIC) om de visualisatiediepte van de confocale microscoop te vergroten van ¢þ–þ μm naar Õ¢þ–þþ μm. Naast het experimentele luik werd ook een analytische luik geïmplementeerd om de beeldgegevens semiautomatisch te verwerken. So.- ware (DuL.êu§) werd ontwikkeld om de microvasculatuur te segmenteren en de vertakkingstopologie en geometrische eigenschappen van de hepatische vasculatuur te kwantiťceren.

Hoofdstuk ¢. Vasculaire hermodellering van de rattenlever tijdens cirrogenese

De levervasculatuur (van ratten) ondergaat desastreuze veranderingen tijdens cirrogenese. Kennis enmorfologische data over de vasculaire hermodellering zijn echter nog beperkt, maar zijn wel cruciaal om het ziekteproces beter te begrijpen. In dit hoofdstuk trachten we deze lacune op te vullen door de hepatische macro- en microvasculatuur van de rat te kwantiťceren op verschillende tijdspunten tijdens cirrogenese. Cirrose werd chemisch geïnduceerd in ratten door middel van het thioaceetamide(TAA)-model. De levervasculatuur van enkele ratten werd geťxeerd op vier verschillende tijdspunten (þ, ä, Õó en Õ. weken) en gevisualiseerd door het gebruik van vasculaire afgietsels en geavanceerde immuunhistochemie (geoptimaliseerd in hoofdstuk ¦). Vervolgens werden de hepatische vaatbomen gereconstrueerd en geanalyseerd over meerdere lengteschalen heen. Door het ťtten van trendlijnen aan de morfologische data werd de impact van cirrose op de levervasculatuur gekwantiťceerd. Op macroniveau stelden we vast dat regeneratieve noduli de soepele veneuze bloedvaten progressief samendrukten vanaf Õó weken TAA-toediening, met een sterk verminderde perfusie doorheen deze bloedvaten tot gevolg. Op het microniveau observeerden we eveneens een progressieve toename van de vasculaire weerstand van sinusoïden. De mate waarin de weerstand toenam was afhankelijk van de locatie, aangezien de aantasting sterker was voor de sinusoïden die zich dicht tegen het leveroppervlak bevonden. De gegenereerde datasets vormden de basis van het computermodel beschreven in hoofdstuk ä.

Hoofdstuk ä. Modelleren van de hemodynamica bij ratten tijdens

cirrogenese

Cirrose wordt gekenmerkt door een ernstig beschadigde leverarchitectuur die leidt tot een progressieve toename van de intrahepatische vasculaire weerstand. Een verhoogde vasculaire weerstand zal resulteren in de ontwikkeling van portale hypertensie alsook abnormaliteiten van het bloedvatenstelsel. In dit hoofdstuk hebben we, door middel van een zogenaamd lumped parameter model, de impact onderzocht van de hepatisch vasculaire weerstand op de gehele bloedcirculatie van de rat tijdens cirrogenese. De vertakkingstopologie van de hepatische vaatbomen uit hoofdstuk ¢ werd geanalyseerd en gekwantiťceerd per leverlob. De geometrische analyses (lengte, straal en aantallen bloedvaten) leverden de input om een elektrisch analoog levermodel te ontwikkelen. Dit levermodel werd vervolgens geïntegreerd in een elektrisch analoog model van de gehele bloedcirculatie van ratten. Zodoende kon het geïntegreerde model de hepatische en globale hemodynamica voorspellen voor verschillende stadia van de cirrogenese.De simulaties illustreerden duidelijk het e.ect van de toenemende vasculaire weerstand op de hemodynamica. Na Õó weken TAA-toediening werden portale hypertensie en abnormale stromingspatronen in bepaalde leverlobben waargenomen (bijv. terugstroom in de PV-vaatboom). Deze fenomenen worden regelmatig opgemerkt bij patiënten met cirrose. Nadien werd het model uitgebreid om het e.ect van compensatiemechanismen van de bloedomloop in het geval van cirrose te simuleren. De imulatieresultaten toonden aan dat deze mechanismen de globale hemodynamica ernstig verstoren en bijdragen tot een verergering van de portale hypertensie.

Hoofdstuk ß. Conclusies en toekomstperspectieven

Een belangrijke verwezenlijking van dit onderzoek is de implementatie van een methodologisch kader om de vasculaire hermodellering van de rattenlever tijdens cirrogenese te kwantiťceren. Dit methodologisch kader leverde nieuwe en uniekemorfologische data op van de hepatischemacro- en microcirculatie doorheen de ontwikkeling van cirrose. Deze data vormden de basis van een computermodel om de bloedcirculatie te simuleren tijdens verschillende fases van het ziekteproces. Aan de hand van dit computermodel konden we de gevolgen van cirrose inschatten op de globale hemodynamica en verworven we nieuwe inzichten in het ontstaan van portale hypertensie. Dit werk vormt een stap voorwaarts in het ontrafelen van de complexe pathogenese van cirrose. Niettemin is verder onderzoek ongetwijfeld nodig om de volledige puzzel op te lossen. Eén van de interessante gebieden voor toekomstig onderzoek is het modelleren van de wisselwerking tussen de leverperfusie en -functie in het geval van cirrogenese.