Eiwitten zijn een van de belangrijkste spelers in de complexe regulatorische netwerken die aan de basis liggen van vele biologische processen. Hoewel sommige onafhankelijk kunnen werken, hebben de meeste eiwitten interacties met andere eiwitten of macromoleculen, zoals RNA en DNA, nodig om hun functie uit te oefenen. Om het functioneel analyseren van planteneiwitten te vergemakkelijk
werden er in het verleden meerdere technieken ontworpen (Hoofdstuk 1), die vaak een genetisch geëncodeerde tag implementeren om het gebruik van eiwitspecifieke antilichamen te vermijden. Twee zeer krachtige toepassingen die dergelijk taggingsysteem toepassen zijn tandemaffiniteitszuivering (TAP) gevolgd door massaspectrometrie om eiwit-eiwit interacties te identificeren, en chromatine
immunoprecipitatie (ChIP) gekoppeld aan de nieuwste generatie sequeneringsmethoden om eiwit-DNA interacties te bepalen Een derde toepassing voor eiwittagging is gelinkt met het visualiseren van de lokalisatiepatronen van een eiwit door middel van fluorescente eiwittags. Er bestaan echter geen tags in planten die deze drie technieken combineren. Dit maakt het bestuderen van complexe
biologische processen zoals bladgroei en onwikkeling, waarbij een grote waaier aan regulatorische eiwitten een rol spelen (Hoofdstuk 2) zeer moeilijk. Dit onderzoek focuste zich op het ontwerpen en evalueren van een multifunctionele TAP tag, genaamd GSyellow, die kan gebruikt worden om interactiepartners en lokalisatiepatronen te identificeren van een bepaald eiwit in zowel Arabidopsis
thaliana en Zea mays (Hoofdstuk 3). Door data bekomen via TAP, ChIP en lokalisatieëxperimenten te combineren konden we eerder gerapporteerde mechanismen van een selecte set eiwitten bevestigen in hun ontwikkelingscontext.
Onze data tonen dus aan dat de GSyellow tag even goed presteert als andere tags die gebruikt worden in functionele eiwitanalyse in planten. Daarnaast hebben we ook een alternatieve werkwijze opgesteld in Arabidopsis om genetische TAP-getagde fusieëiwitten te maken waarbij de endogene regulatorische sequenties die rond het gen van interesse liggen worden behouden (Hoofdstuk 4). Hiervoor werd gebruik gemaakt van homologe recombinatie in combinatie met transformatie competente artificiële chromosomen (TAC), een process dat beter bekend staat als recombinering.
Om een dieper inzicht te krijgen in de verschillen die bekomen worden met TAP en ‘pull-down’ experimenten werden er bovendien een aantal complexzuiveringen uitgevoerd in zowel Arabidopsis als Zea mays met beide technieken (Hoofdstuk 5). Door de resultaten te vergelijken werd het duidelijk dat beide experimentele methoden verschillende interactietypes kunnen oppikken, en dat de mogelijkheid om te kiezen tussen beide opties met de GSyellow tag een grote flexibiliteit levert in
eiwit-eiwit interactiestudies.
Tot slot werd de bruikbaarheid van de GSyellow TAP tag in de functionele analyse van
eiwitcomplexen in een ontwikkelingscontext aangetoond in Zea mays (Hoofdstuk 6). Hierbij werd gebruik gemaakt van de transcriptionele co-activator ANGUSTIFOLIA3 (ZmAN3), welke een gekende regulatorische rol speelt in bladgroei. De vroeger bekomen TAP data van ZmAN3, waarbij aangetoond werd dat het eiwit preferentieel bindt met transcriptiefactoren van de GROWTH REGULATING FACTOR (GRF) familie in de delende weefsels van de groeizone, werd hier bevestigd. Bovendien toonde de identificatie van doelwitgenen via ChIPseq, op zowel de volledige groeizone als op de delende en expanderende weefsels apart, dat ZmAN3 de expressie regelt van genen die betrokken zijn in het behoud van de proliferatieve eigenschappen van de groeizone. Onze gegevens duiden ook
aan dat de regulatorische feedback loop, waarbij GRF expressie geregeld wordt door binding van ZmAN3-GRF aan zijn eigen promotor, geconserveerd is tussen monocotyle en dicotyle planten.
De multifunctionele GSyellow TAP tag die hier geëvalueerd werd kan dus worden gebruikt om de functie van eiwitcomplexen te bestuderen in een ontwikkelingscontext in zowel monocotyle als dicotyle planten. Door de functie van het groeiregulatorische ZmAN3 eiwit in bladgroei te analyseren werd aangetoond hoe de GSyellow tag kan worden toegepast om een inzicht te vergaren in complexe
biologische processen. Dit kan ons in de toekomst helpen voor de preciezere engineering van de onderliggende pathways.