Project

Nanodeeltjes- geïnduceerde autofagie : ontrafelen van de impact op de toxiciteit van nanodeeltjes en de therapeutische werkzaamheid

Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Medical and health sciences
    • Biomarker discovery and evaluation
    • Drug discovery and development
    • Medicinal products
    • Pharmaceutics
    • Pharmacognosy and phytochemistry
    • Pharmacology
    • Pharmacotherapy
    • Toxicology and toxinology
    • Other pharmaceutical sciences
Trefwoorden
nanopartikel-geinduceerd autofagy retinale gentherapie nanotechnologie nanotoxicologie
 
Projectomschrijving

Nanotechnologie is dankzij wereldwijd onderzoek geëvolueerd tot één van de belangrijkste drijfkrachten van de huidige wetenschappelijke vooruitgangen in de 21ste eeuw. Het veld is verbazingwekkend uitgebreid in het afgelopen decennium, waarbij naar schatting bijna 10% van alle publicaties die in Web of Science zijn geïndexeerd in 2016 nanotechnologie betrof. Niettegenstaande dit diepgaand onderzoek is de vertaling van nanopartikels (NP's) naar de kliniek eerder beperkt. In het geval van organische NPs zoals liposomen en polymere partikels komt dit voornamelijk door hun gebrek aan efficaciteit wat veroorzaakt wordt door de vele intra- en extracellulaire barrières die ze tegenkomen. De translatie van anorganische deeltjes wordt voornamelijk beperkt door veiligheidsbelangen gezien veel van deze partikels, waaronder Quantum Dots (QD’s) zijn samengesteld uit zware metalen waarvan geweten is dat ze toxisch zijn. Zoals bevestigd in deze thesis, is reeds vastgesteld dat het de fysicochemische kenmerken zijn die bepalen hoe een cel een NP ‘ziet’ en dus zo de werkzaamheid en toxiciteit van het NP dicteert – what you see is what you get!

Hoewel deze perceptie volledig wordt erkend door de nanotechnologie gemeenschap, blijft het een uitdaging om specifieke fysicochemische eigenschappen te koppelen aan bepaalde biologische effecten. Hierdoor wordt het dan ook moeilijk om het therapeutisch vermogen of potentiële toxiciteit van een NP te voorspellen. Dit is voornamelijk te wijten aan gebrekkig project design, het ontbreken van representatieve modellen en de inherente complexiteiten die samengaan met het werken met NPs. De moeilijkheid om NP fysicochemie te koppelen aan gewenste of ongewenste effecten is een probleem dat bijna elk onderzoeksveld beïnvloedt dat als doel heeft voordeel te halen uit de unieke en krachtige eigenschappen van NPs. In deze thesis hebben we ons echter gefocust op het helpen oplossen van deze problemen in context van retinale genaflevering (Deel I, hoofdstuk 1-4) en autofagie (Deel II, hoofdstuk 5 en 6).

In Hoofdstuk 1 hebben we een overzicht gegeven van de meest voorkomende verworven ziekten alsook de best gedocumenteerde erfelijke retinale aandoeningen die kunnen worden behandeld met retinale gentherapie. We beschreven verder de morfologie en de vele functies van de Müller cel, het doelceltype voor onze niet-virale aflevering van genen.

In hoofdstuk 2 gaven we een overzicht van publicaties die de fysicochemische eigenschappen van therapeutica en hun dragers bespreken. Hieruit concludeerden we dat de ideale fysiochemische kenmerken van een therapeutische (drager) sterk afhangen van de barrière die het NP moet overwinnen en dus ook van de gewenste toedieningsroute. We ontdekten verder 208 │ Samenvatting en conclusies dat bijna elke barrière veranderingen ondergaat in functie van leeftijd en ziekte, wat een belangrijke invloed kan hebben op het evalueren van het potentieel van dragers om deze barrières te overbruggen. We hebben veel nuttige in vitro en ex vivo methodes en modellen gevonden om barrières voor medicijnafgifte in het achterste segment van het oog te bestuderen, hoewel er volgens ons nog steeds veel behoefte is aan meer eenvoudige en representatieve modellen.

Overtuigd van dit laatste argument presenteerden we in hoofdstuk 3 de zogenaamde 'vitreoretinale explant', een nieuw ex vivo model dat speciaal is ontwikkeld om de interactie van nanogeneesmiddelen met de vitreoretinale (VR) interface te onderzoeken. Deze interface omvat het vitreum en de inner limiting membrane (ILM), beide erkende hindernissen voor de aflevering van geneesmiddelen. We bevestigden de levensvatbaarheid van dit nieuw model en valideerden de waarde ervan met behulp van polystyrene partikels. Gezien 40 nm partikels efficiënter de VR interface doorkruisten dan 100 of 200 nm NPs, konden we concluderen dat de afgifte van NPs in de retina afhankelijk is van de grootte van NPs. We ontdekten bovendien dat het verwijderen van het vitreum, zoals vaak wordt gedaan voor de kweek van conventionele explants, leidde tot een overschatting van de NP-opname en concludeerden verder dat de voornaamste barrière die overwonnen moet worden voor om de retina te bereiken onbetwistbaar het ILM is. Deze VR explant is momenteel het meest representatieve ex vivo model op de markt dat voldoende lang in leven kan gehouden worden om de opname van NPs in de retina te bestuderen.

In hoofdstuk 4 hebben we een elementaire set-up toegepast om te onderzoeken of Müller cellen, die we beschouwen als een ideaal doelwit voor neuroprotectieve strategieën, in staat zijn om lipoplexen efficiënt te verwerken en hun pDNA- of mRNA-lading tot expressie te brengen. We ondervonden dat mRNA-lipoplexen beter presteerden dan de DNA-lipoplexen bij transfectie van gezonde Müller-cellen, omdat zowel het aantal getransfecteerde cellen als het niveau van GFP-expressie hoger was voor mRNA-lipoplexen. In Müller cellen die werden blootgesteld aan hyperglycemie, oxidatieve stress of hypoxie werden geen veranderingen in mRNA-geïnduceerde expressie waargenomen in vergelijking met gezonde Müller cellen. Aan de andere kant vonden we dat Müller cellen behandeld met oxidatieve stress of hypoxie gevoeliger waren voor de door lipoplexen geïnduceerde toxiciteit, dit terwijl hyperglycemie een beschermend effect had. Hoewel ongetwijfeld meer onderzoek nodig is, geeft deze studie aan dat, ondanks een stressvolle omgeving, Müller cellen in staat zijn om lipoplexen op te nemen en hun nucleïnezuurlading tot expressie te brengen.

Hoofdstuk 5 gaf een overzicht van de meest relevante publicaties handelend over NP-gemedieerde veranderingen in autofagie dit met het oog op het onderzoeken van de interacties tussen NP fysicochemie en veranderingen in autofagie. We hebben inderdaad verschillende NP-eigenschappen naar voren kunnen brengen die hoogstwaarschijnlijk de mate of manier van NP geïnduceerde verstoring van autofagie beïnvloeden, waaronder grootte, lading en chemische samenstelling. Vanwege de tekortkomingen van sommige studies en de tegenstrijdige beweringen in de literatuur was het echter vrijwel onmogelijk om algemene conclusies te trekken. We hebben daarom geoordeeld dat systematische studies die voldoende karakteriseringsgegevens bevatten ons enorm zouden kunnen ondersteunen om de impact van NP fysicochemie op NP-geassocieerde autofagiewijzigingen te verduidelijken.

Op basis van deze argumentatie hebben we in hoofdstuk 6 een onderzoek uitgevoerd met als doel de invloed van QD coating op lysosomale integriteit en autofagie zorgvuldig the definiëren. Onze studie toonde aan dat de cellulaire effecten geïnduceerd door QDs op HeLa cellen sterk werden gedicteerd door de coating (zijnde MPA of PEG) van de overigens identieke deeltjes. MPA-gecoate QDs bleken zeer compatibel te zijn als gevolg van lysosomale activering en reductie van ROS, twee cellulaire responsen die de cel helpen om te gaan met NP-geïnduceerde stress. Daarentegen waren PEG-gecoate QDs aanzienlijk meer toxisch als gevolg van een toename in ROS productie en lysosomale stoornissen. Deze stoornissen resulteerden vervolgens in afwijkingen in autofagie die hoogstwaarschijnlijk bijdroegen aan de geobserveerde toxische effecten. Samengevat heeft ons onderzoek aangetoond dat voor biomedische toepassingen het coaten van QDs met MPA een betere strategie is dan met PEG.

In Hoofdstuk 7 hebben we de vooruitgang in retinale gentherapie en nanotoxicologie samengevat en mogelijke uitdagingen besproken die NPs verhinderen om verder in de klinische stadia te geraken. We hebben verschillende richtlijnen naar voren gebracht waarvan we denken dat ze het nano-veld kunnen helpen om vooruitgang te boeken, en hebben deze tot een algemene benadering omgevormd die onderzoekers zou kunnen helpen bij het overwinnen van de NP-barrières na intravitreale injectie.