Project

Niet-virale gentherapie : het overwinnen van de endosomale barrière

Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Medical and health sciences
    • Laboratory medicine
    • Medical systems biology
    • Laboratory medicine
    • Medical systems biology
    • Molecular and cell biology
    • Laboratory medicine
    • Medical systems biology
    • Molecular and cell biology
Trefwoorden
niet-virale gentherapie Nanomedicijnen
 
Projectomschrijving

Het afleveren van therapeutisch relevante genen aan hun correcte moleculaire target veronderstelt de overwinning op een complexe serie van biologische barrières.
Vermits naakte nucleïnezuren niet opgewassen zijn tegen de
verdedigingsmechanismen van ons lichaam worden afleveringsvectoren ontwikkeld die de therapeutische genen doorheen een waaier van hindernissen moeten leiden.
Gedurende de laatste decennia zijn de niet-virale vectoren naar voor getreden als beloftevolle carriers omwille van verscheidene aantrekkelijke eigenschappen zoals onder meer het gemak van productie, de mogelijkheid om grote nucleïnezuren te
verpakken en hun verhoogde veiligheid in vergelijking met virale vectoren. Ondanks hun vele voordelen lijken niet-virale vectoren (ook wel nanopartikels genoemd) helaas therapeutische efficiëntie te missen. Om voldoende efficiëntie te bereiken geloven wetenschappers wereldwijd dat men bij het ontwerpen van nanomedicijnen rekening moet houden met de verschillende biologische barrières die het nanomedicijn zal
tegenkomen wanneer het toegediend wordt. Het rationeel ontwerpen van nanopartikels hangt echter af van onze fundamentele kennis over de verschillende barrières én over de interactie tussen nanomedicijnen en deze barrières. Het
ontwerpen van een nieuwe generatie aan niet-virale gentherapieën, gebaseerd op fundamentele kennis over de biologische barrières zou kunnen leiden tot het
langverwachte succes van het nanoveld binnen de gentherapie.
In Hoofdstuk 1 starten we met het geven van een overzicht van de verschillende biologische barrières die nanomedicijnen kunnen tegenkomen wanneer ze worden toegediend. Na een korte bespreking van de extracellulaire barrières geven
we een uitgebreide uiteenzetting van de verscheidene intracellulaire barrières. We behandelen de plasmamembraan, exocytose, endosomale ontsnapping, autofagie, het
uitpakken van vectoren, afbraak in het cytoplasma en opname in de kern als prominente intracellulaire barrières die efficiënte aflevering door gebruik van nietvirale vectoren verhinderen. We nemen eerst de fysiologie van de barrières door en
bespreken waarom ze een hindernis vormen voor de aflevering van genen. Vervolgens focussen we op het geven van een overzicht van zowel welgekende als vernieuwende
methodes die toelaten de interactie tussen nanomedicijnen en hun barrières te visualiseren en te kwantificeren. Deze assays en technieken zouden wetenschappers in staat kunnen stellen om de fundamentele kennis bij te schaven en diepgaand begrip
te verwerven in verband met de afleveringsbarrières voor niet-virale gentherapie.
Van de vele intracellulaire belemmeringen wordt de ontsnapping uit endosomen beschouwd als een van de belangrijkste hindernissen in gentherapie. Het is algemeen
bekend dat na endocytische opname de meerderheid van de nanomedicijnen gevangen blijft in het endosomale compartiment. Terwijl deze endosomen matureren, worden de
nanomedicijnen vatbaar voor degradatie door lysosomale enzymen en wordt hun lokalisering naar het cytosol belemmerd. Een frequent gebruikte strategie om de
endosomale membraan te overmeesteren is het gebruik van kationische polymeren waarvan men veronderstelt dat zij het endosoom laten barsten via het zogenoemde protonspons mechanisme. In Hoofdstuk 2 bespreken we de tegenstrijdige rapporten die gedurende de jaren over dit onderwerp gepubliceerd zijn. Het debat over de feitelijkheid van deze hypothese heeft de wetenschappelijke gemeenschap al meer dan 20 jaar in verdeeldheid gebracht. Door de individuele rapporten systematisch te analyseren en te koppelen aan recente bevindingen in verband met aanvullende
factoren voor de protonspons hypothese, komen we tot de conclusie dat deze bevindingen toch niet zo tegensprekend zijn als eerst gedacht. We hopen op deze manier de consensus te bereiken dat de endosomale ontsnappingscapaciteit van protonspons-gebaseerde polymeren afhankelijk is van een delicate balans tussen
osmotische krachten, zwelling van het polymeer en destabilisatie van de endosomale membraan.
In Hoofdstuk 3 hopen we meer inzicht te krijgen in de mechanistische factoren die invloed hebben op de effectieve capaciteit van protonspons-gebaseerde polymeren
om te ontsnappen uit het endosoom. Hiertoe voeren we een gedetailleerde vergelijkende studie uit van de endosomale ontsnappingscapaciteit van JetPEI/pDNA polyplexen in HeLa cellen vs ARPE-19 cellen. We hebben waargenomen dat
JetPEI/pDNA polyplexen hogere transfectielevels konden bereiken in HeLa cellen dan in ARPE-19 cellen, hetgeen kon toegeschreven worden aan een verhoogde endosomale
ontsnapping uit HeLa cellen. Na de evaluatie van verschillende endosomale eigenschappen stelden we vast dat zowel de grootte van de endosomen als de mate waarin de endosomale membraan vatbaar is voor lekken een aanzienlijke invloed
kunnen hebben op protonspons-gemedieerde endosomale ontsnapping. Grotere endosomen hebben een groter aantal polyplexen nodig om een voldoende hoge osmotische druk te creëren om het endosoom te laten barsten. Lekkage van de
endosomale membraan en het bijhorende verlies van de semi-permeabele eigenschap van de membraan voor kleine moleculen doet de opbouw van osmotische druk in het
endosoom teniet, waardoor de ruptuur van het endosoom niet verwezenlijkt kan worden. Het belang van deze intercellulaire variaties werd bevestigd door aanvullend onderzoek in A549 en H1299 cellen. We concluderen dat de effectiviteit van proton
spons-gebaseerde endosomale ontsnapping erg onderhevig is aan intercellulaire variatie als gevolg van endosomale grootte en lekkage van de endosomale membraan.
Deze twee belangrijke factoren werden tot nu toe grotendeels over het hoofd gezien.
Wanneer cellen een vergelijkbare lekkage van de endosomal membraan vertonen, zal de grootte van de endosomen een doorslaggevende rol spelen. Echter, bij hoge niveaus van lekkage zal de opbouw van de osmotische druk niet langer mogelijk zijn, ongeacht de endosomale grootte.
In Hoofdstuk 4 onderzoeken we het gebruik van plasmonische nanopartikels, gekoppeld aan laserbestraling, om op fotothermische wijze endosomale ontsnapping van pDNA te verwezenlijken. Naast de mogelijkheid die deze techniek geeft om een van de meest prominente intracellulaire barrières voor gentherapie te overwinnen, zou deze strategie ook mogelijk maken om de cytosolische afgifte van pDNA te controleren
in ruimte en tijd. Hierdoor zou het een geschikt hulpmiddel kunnen vormen voor het uitvoeren van fundamentele studies met betrekking tot de endosomale barrière. In het
bijzonder onderzochten we het potentieel van JetPEI/pDNA/Au complexen om endosomale ontsnapping van functioneel pDNA in HeLa cellen te induceren na bestraling in een verwarmingsregime (gebruik makende van lage laserenergie) of na de vorming van explosieve waterdamp nanobubbels (gebruik makende van hoge laserenergie). Ongeacht het feit dat beide regimes endosomale rupturen veroorzaakten, waren ze niet in staat efficiënte transfectie te generen in HeLa cellen.
We vermoeden dat de oorzaak hiervan het niet correct functioneren van het pDNA is na blootstelling aan voorgenoemde fotothermale effecten. Andere nanopartikels die
een betere bescherming van het pDNA kunnen garanderen na laserbehandeling zouden moeten overwogen worden.
Om af te sluiten bespreken we in Hoofdstuk 5 de bredere internationale context van het werk in dit proefschrift en zijn relevantie binnen het vakgebied. We beginnen met een algemeen overzicht van de meest belangrijke uitdagingen en
successen in gentherapie. Aangezien de ontwikkeling van efficiënte niet-virale vectoren een aanzienlijke uitdaging vormt, bespreken we vervolgens enkele factoren die de
progressie van nanomedicijnen op het gebied van gentherapie belemmeren. De belangrijkste hindernis voor niet-virale vectoren is het overwinnen van een of meer biologische barrières. We stellen voor dat fundamentele studies, gericht op het verschaffen van inzicht in de biologische eigenschappen van deze barrières en in de interactie tussen nanomedicijnen en de barrières, zouden kunnen leiden tot vernieuwende opvattingen. Deze opvattingen zouden op hun beurt de rationele
ontwikkeling van effectievere nanomedicijnen kunnen bewerkstelligen die de afleveringsbarrières voor niet-virale gentherapie zouden kunnen overwinnen.