Project

Nanobody footprinting als instrument voor hoge resolutie ontleding van cortactine functies die bijdragen in kankercelinvasie en metastase, met perspectief op verdere therapeutische ontwikkeling

Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Natural sciences
    • Biochemistry and metabolism
  • Medical and health sciences
    • Medical biochemistry and metabolism
    • Medical biochemistry and metabolism
    • Medical biochemistry and metabolism
Trefwoorden
Nanobody footprinting kankermortaliteit opvolgen van verschillende cortactine domeinen
 
Projectomschrijving

De ontwikkeling van een tumor wordt gekenmerkt door ongecontroleerde celgroei, veroorzaakt door een genetische achtergrond en door omgevingsfactoren. De grootste oorzaak van kankermortaliteit is de uitzaaiing van kankercellen vanuit de primaire tumor naar andere delen van het lichaam. Kankercellen slagen erin om zich los te maken van de tumor, dringen omliggende weefsels binnen, komen in de bloed- of lymfevaten terecht, en verlaten deze vervolgens op een andere plaats om daar secundaire tumoren of metastasen te vormen. Tijdens de verschillende fasen van metastasevorming gebruiken kankercellen het actine cytoskelet om hun beweeglijkheid mogelijk te maken. Zo zijn er verschillende actine-gebaseerde uitstulpingen die kunnen bijdragen aan die beweeglijkheid, bijvoorbeeld lamellipodia en filopodia aan het frontale gedeelte, en proteolytisch actieve invadopodia aan de ventrale zijde van invaderende cellen. In fysiologische omstandigheden is het actine cytoskelet noodzakelijk voor het behoud van celmorfologie, voor de aanpassing aan omgevingsomstandigheden en voor het genereren van een vooruitsturende kracht tijdens celmigratie. Het actine bindend, multidomein eiwit cortactine is een van de vele regulatoren van actine filament architectuur en dynamiek: cortactine bindt en activeert het Arp2/3 complex, wat leidt tot de vorming van een vertakt actine netwerk, en stabiliseert actine filamenten. Het cortactine eiwit komt tot overexpressie in verschillende types kanker, wat geassocieerd is met verhoogde invadopodia vorming, mobiliteit, invasie en metastase vorming.

Het doel van deze thesis is om de rol van de verschillende cortactine domeinen tijdens invadopodia vorming en functie af te lijnen. Drie verschillende nanobody sets, die elk een verschillende cortactine regio binden, worden hier beschreven: twee NTA nanobodies gericht tegen het N-terminaal (NTA) domein, twee FHP nanobodies die de centrale domeinen binden (de actine bindende herhalingen, het helicaal en proline rijk domein), en een SH3 nanobody dat het SH3 domein herkent. De NTA en FHP nanobody sets werden gegenereerd en gekarakteriseerd, en hun effect op invadopodia en invasie werd vergeleken met het reeds gekarakteriseerde SH3 nanobody. Daarnaast werd de interactie tussen het SH3 nanobody en het SH3 domein in detail bestudeerd.

In deel één worden twee nanobodies tegen het NTA domein gekarakteriseerd en vergeleken met een nanobody tegen het SH3 domein. Beide NTA nanobodies verhinderen cortactine-gemedieerde Arp2/3 activatie (Tabel 1). De twee nanobody sets, i.e. de NTA en de SH3 nanobodies, zorgen in gelijke mate voor een daling van invadopodia vorming, protease secretie, matrix degradatie en protease-gemedieerde invasie, zoals aangetoond door protease inhibitor GM6001. Bovendien verhindert één nanobody ook de interactie van cortactine met het Arp2/3 complex en beïnvloedt het de stabiliteit van invadopodia. Ten slotte stelden we vast dat inhibitie van Arp2/3 complex activatie, door cortactine NTA nanobodies of door Arp2/3 inhibitor CK-666, een groter effect had op invadopodia vorming in hoofd- en hals tumorcellen vergeleken met borstkanker cellen. Dit suggereert dat invadopodia vorming en samenstelling een celtype-afhankelijk proces is.

In deel twee richten we ons op de centrale domeinen van cortactine met twee FHP nanobodies, en vergelijken we hun effecten opnieuw met het SH3 nanobody. Beide cortactine nanobody sets veroorzaken een gelijkaardige reductie van invadopodia vorming, invadopodia-gemedieerde matrix degradatie en invasie (Tabel 1). Het ene FHP nanobody bindt het proline rijk domein en vermindert cortactine tyrosine fosforylering; het andere FHP nanobody bindt ter hoogte van de actine herhalingen maar heeft geen invloed op de interactie met F-actine. Dit wijst op een rol voor de actine bindende regio in invadopodia vorming en functie, onafhankelijk van de rol in actine filamentbinding en stabilisatie.

Tenslotte rapporteren we een structurele analyse van de interactie tussen het SH3 nanobody en het SH3 domein door middel van X-straal kristallografie. Een eerste kristalstructuur werd gevormd bij een zure pH, en om die reden werd een tweede structuur bepaald bij fysiologische pH. Hieruit bleek dat de zuurtegraad geen invloed heeft op de thermodynamische parameters of de structuur van de cortactine-nanobody interactie. De kristalstructuur van het SH3 nanobody met het SH3 domein biedt een verklaring voor twee observaties: ten eerste de specificiteit van het SH3 nanobody voor cortactine en de afwezigheid van kruisreactie met cortactine homoloog HS1. Ten tweede de gerichte inhibitie van de interactie tussen cortactine en WIP door het SH3 nanobody, zonder andere interactiepartners van het SH3 domein te verstoren.

Nanobodies zijn dus een uitstekend middel om op een zeer gedetailleerde manier domein-specifieke functies van cortactine in invadopodia en invasie te onderzoeken. Inhibitie van diverse cortactine domeinen en hun functie resulteert in verschillende effecten op invadopodia aantal, stabiliteit of functie, maar leidt uiteindelijk altijd tot een gelijkaardige afname van kankercel invasie.