Project

Necroptotische eiwitten in ziektes: RIP kinasen als doelwit in inflammatoire aandoeningen en de studie van de rol van MLKL in melanoma ontwikkeling

Looptijd
01-01-2015 → 31-12-2018
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Medical and health sciences
    • Cell death
    • Cell signalling
    • Cancer biology
    • Cancer therapy
Trefwoorden
necroptose inflammatoire ziektes melanoma
 
Projectomschrijving

RIPK1 en RIPK3 zijn kinasen die behoren tot de ‘Ser/Thr receptor-interagerende proteïne kinase’ subfamilie (RIPK) binnen de ‘tyrosine kinase-like’ familie. Deze kinasen zijn cruciale mediatoren van inflammatie, gereguleerde celdood (apoptose en necroptose) en celoverleving. Twee aspecten van RIPK1 bepalen het lot van de cel: RIPK1 kinase activiteit activeert apoptose of necroptose (deze laatste in caspase-8 deficiënte condities) en RIPK1 functioneert ook als platform dat direct betrokken is bij inflammatoire genexpressie en cel-overleving. Deze platformfunctie is onafhankelijk van de RIPK1 kinase activiteit. Necroptose is een vorm van gereguleerde necrotische celdood die geïnitieerd wordt door verschillende receptoren zoals TNFR1, toll-like receptoren en IFNAR1, en wordt gekarakteriseerd door een signalisatie cascade die gedreven wordt door fosforylatie van RIPK1 en RIPK3 en de vorming van een complex, ook wel necrosoom genoemd. Dit necrosoom complex resulteert in fosforylatie van MLKL (mixed lineage kinase-domain like proteïne), een pseudokinase dat geïdentificeerd werd als substraat van RIPK3 en uiteindelijke uitvoerder van necroptose. Necroptose leidt tot de vrijlating van DAMPs (gevaar geassocieerde moleculaire patronen) en cytokines. Deze veroorzaken een inflammatoire reactie die vervolgens aanleiding geeft tot verschillende pathologische aandoeningen. RIPK1 en RIPK3 zijn veelbelovende therapeutische doelwitten aangezien activatie van RIPK1 en RIPK3 essentieel is voor necroptose en deze kinasen betrokken zijn bij vele pathologische condities zoals ischemisch letsel, inflammatoire en neurodegeneratieve ziektes. Nieuwe RIPK1 inhibitoren met groter therapeutisch potentieel zijn nodig aangezien necrostatin-1, de eerste RIPK1 inhibitor, slechts middelmatige activiteit en specificiteit heeft, inclusief een nauw SAR profiel (structuur-activiteit-relatie). Het eerste gedeelte van deze thesis omvat de identificatie en karakterisatie van nieuwe RIP kinase inhibitoren met therapeutisch potentieel om RIPK1/3-gedreven inflammatoire aandoeningen en weefselschade in muizen te verlichten. Enerzijds identificeerden multi-parameter screenings Sorafenib tosylate (een BRAF multi-tyrosine kinase inhibitor) als potente RIPK1 en RIPK3 inhibitor die necroptose inhibeert. Anderzijds leidde rationeel design van structurele Tozasertib analogen (een Aurora kinase inhibitor die ook RIPK1 kan binden) tot nieuwe Tozasertib analogen die de actieve RIPK1 kinase conformatie binden. Aurora kinasen regelen verschillende fases tijdens mitose, inclusief cytokinese (het splitsen van een cel in twee dochtercellen). Inhibitie van deze kinasen zorgt voor mitotische defecten en blokkeert cytokinese, wat uiteindelijk tot celdood leidt. In deze thesis werden Tozasertib analogen ontwikkeld die verhoogde specificiteit hebben voor RIPK1. Zowel Sorafenib tosylate als de Tozasertib analogen beschermen tegen een RIPK1/3-gedreven inflammatoire aandoening in vivo.

Necroptose is niet alleen van belang in inflammatoire en neurodegeneratieve ziektes, maar ook in kanker. Kankers ontwikkelen verschillende eigenschappen om te overleven tijdens de verschillende fasen van het tumor ontwikkelingsproces. Celdood weerstaan is één van deze kenmerken. Deregulatie van RIPK1/RIPK3 werd reeds gerapporteerd in verschillende kanker types, maar er is weinig geweten over de rol van MLKL in tumorigenese en verdere tumor ontwikkeling. Enkele tegenstrijdige resultaten over een mogelijke associatie tussen MLKL expressie en kanker prognose kunnen in de literatuur teruggevonden worden. Enerzijds is lage MLKL expressie geassocieerd met lagere overlevingskansen in darm- en pancreaskanker. Anderzijds werden hogere niveau’s van geactiveerd MLKL (fosfo-MLKL) geassocieerd met lagere overlevingskansen in slokdarm- en darmkanker. De bijdrage van MLKL regulatie en activatie tijdens tumor ontwikkeling is daarom nog steeds onduidelijk. Bovendien kan MLKL celdood-onafhankelijke functies uitoefenen die ook een invloed kunnen hebben op tumor ontwikkeling. In het tweede gedeelte van deze thesis werd de rol van MLKL in melanoma bestudeerd door gebruik te maken van humane melanoma cellijnen afkomstig van melanoma patiënten en een genetisch muis melanoma model met BRAF mutatie en PTEN deletie. Dit model bootst de humane situatie na waarbij mutaties zich opstapelen in melanocyten, wat leidt tot melanoma ontwikkeling en constitutieve activatie van de RAS/RAF/MEK/ERK MAPK signalisatie met celoverleving en proliferatie tot gevolg. Met toenemend aantal mutaties ontwikkelen goedaardige nevi verder tot melanoma die radiaal uitgroeien, gevolgd door verticale groei doorheen de dermis en metastase. De hoge plasticiteit van melanoma cellen en de inductie van ZEB1, een belangrijke transcriptiefactor die bijdraagt tot epitheliale-naar-mesenchymale (‘EMT-like’) transities die het invasief karakter van melanoma cellen verhoogt, draagt bij tot het metastase proces. In deze thesis werd een intrigerende positieve correlatie gevonden tussen MLKL en ZEB1 expressie in melanoma, wat een functionele link suggereert tussen MLKL en EMT-like processen. Ook in patiënten is een laag MLKL RNA expressie gecorreleerd met hogere overlevingskansen, maar dit heeft tot nu geen prognostische waarde. Ondanks het feit dat invasieve melanoma cellen RIPK1, RIPK3 en MLKL expresseren, sterven ze niet via necroptose. Het verstaan van de mechanismen die deze cellen resistent maken tegen necroptose, is noodzakelijk voor de ontwikkeling van celdood-gebaseerde therapieën. Tenslotte heeft MLKL een bescheiden maar significante rol in de groei van melanoma nevi.