Project

Biosensoren en high-throughput engineering voor de productie van secundaire plantmetabolieten met flavonen als proof-of-concept-productklasse in E.coli

Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Natural sciences
    • Plant biology
Trefwoorden
secundaire plantmetabolieten met flavonen Transcriptionele biosensors E.Coli
 
Projectomschrijving

Synthetische biologie en metabolic engineering worden alsmaar essentieler in het onderhouden en hervormen van onze huidige manier van leven. Vooral als het gaat om onze
afhankelijkheid van fossiele brandstoffen, de achteruitgang van de biodiversiteit, milieuvervuiling, de gezondheid van mens en dier en ruimteonderzoek. Deze biologische engineering disciplines worden voortgestuwd door snelle en efficiente DNA lees-en-schrijf ¨technologieen, welke bijvoorbeeld gebruikt worden voor het genereren van immense bibliotheken van microbiele celfabrieken (MCFn) voor de productie van allerhande interessante natuurlijke en zelfs new-to-nature moleculen op een hernieuwbare manier. Ondanks
dit snelle design- en bouwgereedschap wordt de klassieke design-bouw-test-leer cyclus in de ontwikkeling van stammen en producten nog steeds belemmerd door het gebrek aan
snelle en efficiente screenings-, selecteer-, controleer-, en kwantificatietechnologie ¨ een voor ¨de relevante metabolieten.
Vanwege haar intrinsieke metabolische complexiteit, levert de natuur zelf de nodige middelen aan om dit obstakel te overwinnen en dit in de vorm van transcriptionele regulatorische circuits. Deze alomtegenwoordige circuits stellen organismen in staat om veranderingen te detecteren in intra- of extracellulaire moleculeconcentraties, ionconcentraties
en fysische parameters en hierop te reageren. Vanwege deze boeiende eigenschap worden zon regulatorische circuits omgevormd tot transcriptionele biosensoren die in vivo detectie van (meerdere) relevante metabolieten mogelijk maken op een snelle, efficiente en ¨ specifieke manier. Hierdoor hebben transcriptionele biosensoren het potentieel om huidige
strategieen in het veld van synthetische biologie en ¨ metabolic engineering te versnellen en verbeteren door hun gebruik in applicaties zoals high-throughput screening, adaptieve
laboratoriumevolutie (ALE) en dynamische pathway controle.
Bij de ontwikkeling van biosensoren voor specifieke in vivo applicaties zou de bio-ingenieur in kwestie over de mogelijkheid moeten beschikken om de twee fundamentele biosensorkarakteristieken, namelijk de responscurve en de moleculaire specificiteit, volledig naar de hand te zetten. De responscurve geeft de input/output-relatie weer van de biosensor en wordt bepaald door de gevoeligheid en het operationeel en dynamisch bereik. Het moleculaire specificiteitsprofiel bepaald hoe goed een biosensor het onderscheid kan maken tussen verscheidene, meer of minder nauwverwante moleculen. Huidige biosensor engineering principes en strategieen zijn echter ontoereikend voor de specifieke applicaties die ¨ academische en industriele gemeenschap wenst. Daarom werden in dit doctoraal onderzoek ¨ nieuwe biosensor engineering principes en strategieen ontwikkeld, ge ¨ eevalueerd en getest ¨
om de creatie van op maat gemaakte transcriptionele biosensoren mogelijk te maken.
Als case study werden transcriptionele biosensoren ontwikkeld, op maat aangepast en toegepast voor het monitoren en kwantificeren van specifieke flavono¨ıden in Escherichia coli. Flavono¨ıden vormen een grote groep gespecialiseerde plantaardige metabolieten die,
C-6 SUMMARY vanwege hun uitgebreide structurele diversiteit, een brede waaier aan biologische activiteiten vertonen en daardoor interessante industri¨ıle applicaties voortbrengen. Hierdoor zouden flavono¨ıde-responsieve biosensoren van groot belang kunnen zijn voor de snelle en efficiente ontwikkeling en optimalisatie van ( ¨ E. coli)-gebaseerde MCFn ten aanzien
van de duurzame productie van flavono¨ıden. Na een uitgebreid overzicht van de huidige biosensor engineering strategieen werd een synthetisch biosensor chassis (pSynSens, Syn- ¨
thetische Sensor) geconstrueerd op basis van het natuurlijke flavono¨ıde-responsieve regulatorische circuit uit Herbaspirillum seropedicae en vertoont interessante responskarakteristieken tegenover naringenine, de centrale molecule in de biosynthetische flavono¨ıde pathway. De pSynSens biosensor omvat een biosensorarchitectuur waarin de detector en effector module werden ontkoppeld om onafhankelijke en informatieve engineering mogelijk te maken in elke module. Vanwege deze gemodulariseerde architectuur werd de pSynSens
biosensor gebruikt als biosensor chassis voor de implementatie en evaluatie van nieuwe strategieen voor het op maat aanpassen van zowel de responscurve (met betrekking tot naringenine) en het specificiteitsprofiel (met betrekking tot de drie nauw verwante flavono¨ıden, naringenine, apigenine en luteoline).
De mogelijkheid om de responscurve van een biosensor af te stellen naargelang de gewenste eigenschappen is cruciaal voor gepaste biosensorapplicatie. In de context van dit doctoraal onderzoek werd het ontwikkelde pSynSens biosensorchassis aangepast met behulp van een snelle module-gebaseerde strategie om de responscurve voor naringenine op maat
aan te passen. Met behulp van deze strategie werden de detector en effector module apart aangepast om twee collecties te genereren van elke tien synthetische biosensor varianten die een brede waaier aan responscurve parameters vertonen. Om de extensieve karakterisatie en vergelijking van biosensor responscurves te vergemakkelijken werden de beschikbare wiskundige concepten uitgebreid met een ruisparameter en een applicatie-georienteerde ¨
berekening van het operationeel bereik. Elke collectie vertoont een unieke diversiteit aan responskarakteristieken die een 128-voudige variatie in dynamische bereiken, 2,5-voudige
variatie in operationele bereiken en 3-voudige variatie in ruisniveaus overspannen. Zowel deze gestaafde strategie als de nieuwe biosensorcollectie zelf dragen bij tot toekomstige inspanningen voor het op maat aanpassen van responscurves in biosensoren in het algemaan, alsook tot flavono¨ıde-responsieve biosensorapplicaties en als interessante alternatieven op de veelgebruikte LacI-, TetR- en AraC-gebaseerde induceerbare circuits.
De immense varieteit aan metabolieten in ¨ e´en organisme, en zelfs in ´ e´en heterologe biosynthetische pathway, vereist van transcriptionele biosensoren de eigenschap om te reageren
op slechts e´en specifiek metaboliet naar keuze zonder de interferentie van andere, nauwverwante metabolieten. In dit doctoraal onderzoek werden twee chimera-gebaseerde strategieen ontwikkeld en ge ¨ evalueerd die de detector en effector module van het niet-specifieke ¨ flavono¨ıde-responsieve pSynSens biosensorchassis apart modificeren om het specificiteitsprofiel op maat aan te passen. Als case study werd stringente luteoline-specificiteit beoogd en behaald door specifieke onderdelen van een E. coli-incompatibel luteoline-specifiek regulatorisch circuit uit Sinorhizobium meliloti te introduceren in het pSynSens biosensorchassis in verschillende configuraties op zowel DNA- als eiwitniveau. Met behulp van beide strategieen werden nieuwe chimere biosensorvarianten gegenereerd met verhoogde ¨
luteolinespecificiteit. Terwijl het originele pSynSens biosensorchassis een luteoline-specificiteit van slechts 27,5% vertoont, vertonen de chimere biosensorvarianten luteolin-specificiteiten tot 95,3%. De ontwikkelde chimera-gebaseerde strategieen verschaffen een snelle, modulaire ¨
en efficiente route richting op maat gemaakt moleculaire specificiteit in biosensoren. Daarnaast bewees het biosensorchassis een robuust geraamte te zijn voor de incorporatie van onderdelen van regulatorische circuits die anders niet bruikbaar zijn in E. coli. Tot slot omvat deze nieuwe biosensorcollectie zowel de eerst gerapporteerde luteoline-specifieke biosensor als de eerste chimere LysR-type biosensorcircuits in het huidige biosensorrepertoire.
Om de snelheid en performantie aan te tonen van biosensor-aangedreven metabolic engineering strategieen werd een MCF ontwikkeld voor de ¨ de novo biosynthese van naringenine
vanuit glucose door de introductie en balancering van de heterologe naringenine biosynthetische pathway in E. coli. Meer bepaald werd deze vier-enzym lange pathway geassembleerd door verschillende enzymvarianten te combineren in een e´enstaps assemblagereactie ´
met verschillende promotorsequenties (met verschillende promotorsterktes) voor elk van de vier enzymatische stappen. De resulterende bibliotheek van circa 4 12 verschillende pathway expressieplasmiden werd getransformeerd in E. coli samen met e´en van de ontwikkelde ´ op maat gemaakte naringenine-responsieve synthetische biosensoren, geselecteerd vanwege zijn specifieke set aan responsecurve parameters die best geschikt leken voor deze highthroughput screeningsaanpak. Vanuit deze bibliotheek werden MCFn ge¨ıdentificeerd die naringenine titers vertonen tot 35,6 mg/L. Bovendien bewees de toegepaste biosensor een precies en accuraat predictiemiddel te zijn voor in vivo naringenine productie alsook een doeltreffend middel te zijn voor high-throughput screening. Vervolgens werden aanvullende metabolic engineering inspanningen geleverd en onderzocht om luteoline biosynthese
mogelijk te maken als proof-of-concept gespecialiseerde flavono¨ıde. Hiervoor werden specifieke plantaardige (membraan-gebonden) enzymvariantcollecties geconstrueerd en afzonderlijk gescreend voor de in vivo productie van apigenine vanuit naringenine en luteoline vanuit apigenine. Twee MCFn werden hieruit ge¨ıdentificeerd die 48,8 mg/L apigenine vanuit naringenine en 1,39 mg/L luteoline vanuit apigenine produceren. Naast het aantonen van
de doeltreffendheid van biosensor-aangedreven metabolic engineering hebben alle drie de geproduceerde flavono¨ıden interessante industriele toepassingen waarvan de naringenine- ¨
producerende MCF eveneens het potentieel bezit voor de biosynthese van een brede waaier aan andere gespecialiseerde flavono¨ıden. Algemeen werden gedurende dit doctoraal onderzoek nieuwe engineering principes en
strategieen tot stand gebracht en toegepast die kunnen gebruikt worden voor het op maat ¨
maken van transcriptionele biosensoren, welke toegepast kunnen worden op een brede
waaier aan interessante moleculen om de design-bouw-test-leer cyclus in meerdere biologische engineering disciplines te versnellen en verbeteren. Bovendien werd het huidige biosensorrepertoire uitgebreid met een collectie synthetische flavono¨ıde-responsieve biosensoren in E. coli die op maat gemaakte responscurves en specificiteitsprofielen vertonen en nu beschikbaar zijn voor gebruik in toonaangevende applicaties voor de ontwikkeling en optimalisatie van flavono¨ıde-producerende MCFn. Tot slot werden deze biosensoren toegepast voor de succesvolle ontwikkeling en optimalisatie van MCFn die de novo naringenine produceren, het centrale metaboliet in de grote en industrieel interessante groep van gespecialiseerde plantaardige metabolieten, namelijk flavono¨ıden.