Stichting tegen Kanker (https://www.kanker.be) schat dat tegen het einde van 2018, wereldwijd ongeveer 18 miljoen individuen een kankerdiagnose zullen gekregen hebben. Cijfers uit de Verenigde Staten geven aan dat meer dan 21.000 van deze nieuwe patiënten getroffen zullen zijn door acute
myeloïde leukemie (AML), de meest voorkomende kanker van de bloedcellen. Bijna de helft van deze nieuwe kankerpatiënten zullen 65-plussers zijn, en hoewel de kans op genezing bij jongere patiënten de afgelopen jaren sterk is vooruitgegaan, blijft de prognose in net deze leeftijdsgroep dramatisch: 2
jaar na diagnose zal slechts 15% van hen nog in leven zijn.
Studies tonen aan dat het constitutieve proliferatiesignaal van de AML-kankercellen, de zogenaamde blasten, in 20-30% van alle nieuwe patiënten afkomstig is van een FLT3 variant met
intracellulaire carcinogene mutaties. Aanwezigheid van dergelijke mutaties is gecorreleerd met een ongunstige prognose, waarbij een verhoogd risico op herval na initiële remissie zich vertaalt in een grotere kans op sterfte. De hoge prevalentie van FLT3-mutaties in AML-patiënten, heeft dit
membraaneiwit de afgelopen twee decennia in het middelpunt van de farmaceutische belangstelling geplaatst. Ondanks hoge verwachtingen, bleken klinische studies echter vooral aan te tonen dat de zogenaamde tyrosine-kinase-inhibitoren (TKIs) wel snel leidden tot remissie, maar deze nooit lang konden aanhouden. De goedkeuring van midostaurine voor de behandeling van nieuwgediagnostiseerde AML-patiënten met mutaties in FLT3, midden 2017, beloofde het verhoopte
keerpunt te worden in de gerichte behandeling van deze patiënten. De observatie dat zelfs met deze nieuwe behandeling, slechts iets meer dan de helft van de patiënten 4 jaar na diagnose nog leven, is echter tekenend voor de prangende nood aan verdere optimalisatie van therapieën.
FLT3 is een transmembraan eiwit bestaande uit een extracellulair ligandbindend domein (ECD), een enkele transmembranaire helix (TM) en een intracellulair tweedelig tyrosine-kinasedomain (TKD). Op basis van deze opbouw, wordt FLT3 ingedeeld in de 3de klasse van de tyrosine-kinase receptoren (RTKIII), samen met CSF-1R, KIT receptor, PDGFRα en PDGFRβ. In inactieve toestand bevindt elk van deze receptoren zich aan het celmembraan als een monomeer. De kinase-activiteit wordt hierbij onderdrukt
door een interactie van de juxtamembraanregio met beide lobben van het kinase. Activatie van de receptor wordt geïnitieerd door binding van het ligand met het ECD van 2 receptoren. Hoewel dergelijke interactie voor elk lid van de RTK-III leidt tot een transactivatie van TKDs, manifesteert FLT3
zich als de enige uitzondering door de manier waarop: structurele en biofysische studies tonen aan dat FLT3 de enige receptor is waarvoor er geen ligand-geïnduceerde interacties waargenomen konden worden tussen membraan-proximale domeinen van 2 ligand-geassocieerde receptoren. Met een
paradigma voor een receptoractivatie waarin expliciet geen rol is weggelegd voor extracellulaire reciproke receptorinteracties, is FLT3 inderdaad de vreemde eend in de bijt.
Terzelfdertijd hebben we kennis van 2 oncogene puntmutaties in het ECD waarvan is aangetoond dat ze leiden tot een constitutieve activatie van de receptor. Ondanks het atomaire model van het ECD, kon tot op heden de transformerende eigenschappen van deze mutaties niet gekaderd worden binnen het huidige paradigma van receptoractivatie. Naar analogie met de andere receptoren, is er wel een vermoeden dat ze leidden tot een ligand-onafhankelijke dimerisatie van receptoren, gemedieerd door de membraan-proximale domeinen - zij het dus via exact datzelfde mechanisme dat
opvallend afwezig is bij wild-type FLT3 activatie.
In Hoofdstuk A wordt een korte inleiding gegeven tot de hematopoëse en de rol van FLT3 hierin. Vervolgens wordt het huidige paradigma van receptoractivatie besproken, en toegelicht hoe ligandbinding aan de extracellulaire domeinen leidt tot een activatie van de intracellulaire kinaseactiviteit. Deze kennis laat toe om het moleculair mechanisme te bespreken achter de 2 types FLT3- mutaties die het vaakst voorkomen bij AML-patiënten, tezamen met hoe de farmaceutische industrie tracht deze gemuteerde receptoren te inhiberen. Er wordt dieper in gegaan op voorlopige klinische
resultaten van de zogenaamde tyrosine-kinase-inhibitoren, aangezien de problematiek die met dergelijke doelgerichte therapieën gepaard gaat, de aanleiding geeft tot het onderzoek besproken in Hoofdstuk C.
De dichotomie in de rol van de membraan-proximale regio’s tussen enerzijds opmerkelijk afwezig in wild-type condities, en prominent aanwezig in een gemuteerde context anderzijds, vormt de rationale voor het onderzoek gepresenteerd in Hoofdstuk B. Het probleem wordt benaderd door 2 nieuwe
liganden te ontwikkelen die het mogelijk maken om m.b.v. isothermale titratiecalorimetrie (ITC) eventuele coöperatieve mechanismen in de ligand-receptorbinding bloot te leggen.
Vermits de resultaten van elk experiment, uitgevoerd met de nieuw ontwikkelde liganden, zullen gespiegeld worden aan de resultaten met het wild-type ligand, dienden we er ons eerst van te vergewissen dat deze laatste van goede kwaliteit was. Hiervoor werden 3 experimenten uitgevoerd, die samen aantonen dat het in-huis geproduceerde ligand inderdaad in vitro, ex vivo en in vivo het fysiologisch effect van het endogeen ligand op potente wijze imiteert.
Vervolgens wordt voor elk van de twee nieuwe liganden, het monomere FLL27D en heterodimere FLWT/KO, toegelicht welke strategie gevolgd werd om deze te genereren. We tonen aan dat beide liganden na productie de fysicochemische eigenschappen vertoonden die we verwachtten, en bewijzen dat ze elk in staat zijn om slechts één receptor te binden – in tegenstelling tot het wildtype ligand. De hoge expressie-opbrengst van FLL27D liet bovendien toe om de eiwitkarakteristatie een niveau hoger te tillen m.b.v. X-stralen eiwitkristallografische experimenten. Hiermee konden we
overtuigend aantonen dat de puntmutatie inderdaad enkel een structurele adaptatie veroorzaakt ter hoogte van de dimerisatie-site, zonder de bindings-site van de receptor te beïnvloeden. Naast de validatie van FLL27D voor het gebruik in een coöperativiteitsanalyse met behulp van ITC, geven deze Xstralen diffractie-experimenten ons voor het eerst een uniek beeld van de receptorconformatie in een inactieve toestand. We namen hierbij een opmerkelijke compacte toestand van de receptor waar, waarin het eerste membraan-distale domein een interactie aangaat met het meest membraanproximale domein. Deze nieuwe kijk op een mogelijks auto-inhiberend mechanisme ter hoogte van de extracellulaire regio krijgt dan ook een prominente plaats in het later voorgestelde
activatiemechanisme.
Alvorens over te gaan op de bespreking van de ITC experimenten, wordt toegelicht welke maatregelen er zijn genomen om te verzekeren dat conclusies en vergelijkingen van
thermodynamische parameters gestoeld konden worden op een solide statistische basis – voor zover wij weten, een unicum in het veld van thermodynamische analyses. De ITC experimenten zelf tonen finaal op een ondubbelzinnige wijze aan dat ligandbinding door FLT3 een meerstapsreactie is met 2
coöperatieve gebeurtenissen. De eerste gebeurtenis gaat gepaard met een intra-moleculaire heroriëntatie van het ligand. De tweede en grootste coöperatieve gebeurtenis, is te wijten aan ligandgeïnduceerde receptor-receptor-interacties.
In het tweede luik van Hoofdstuk B wordt getracht het oncogene karakter van 2 klinisch geïdentificeerde oncogene puntmutaties in het ECD te plaatsen in een structureel-mechanistisch kader. De eerste van de twee puntmutanten, een threonine naar isoleucine puntmutatie, vertoonde
onverwacht geen effect in onze biofysische karakterisatie. Verrassend genoeg resulteerde het wel in een hogere-resolutiestructuur van de receptor, waardoor we voor het eerst een atomair model van het 5de domein konden modelleren. Deze liet op zijn beurt toe om de positie te bepalen van de 2de
puntmutatie, een substitutie van serine-451 naar een fenylalanine. De analogie met oncogene mutaties in een gelijkaardige regio van de KIT receptor, versterkte ons vermoeden dat deze mutatie de wederzijdse receptoraffiniteit zou kunnen verhogen, en wel tot een niveau die ligandonafhankelijke receptor-interacties mogelijk maakt.
Vervolgens wordt het effect van de fenylalanine-substitutie op de thermodynamica van ligandbinding volledig ontleed, waarbij we de gevolgen van deze mutatie voor zowel de entropische
kost als voor de enthalpische component, rationaliseren. De observatie dat de substitutie een negatieve invloed uitoefent op de enthalpische component, geeft immers aan dat de mutatie eerder de aard van een bestaande interactie-site beïnvloedt, dan dat het een nieuwe site creëert.
Hoofdstuk B wordt afgesloten met een discussie waarin de impact van de resultaten uitvoerig wordt besproken en finaal een nieuw FLT3-activatiemechanisme wordt voorgesteld. Naast de aanwezigheid van een autoinhiberende extracellulaire conformatie, voorziet dit mechanisme een meer prominente
rol voor de membraan-proximale interacties die FLT3 mechanistisch terug verenigt met zijn RTK-III familieleden.
Na de structureel-biofysische dissectie van ligandbinding aan de extracellulaire regio van FLT3, wordt in Hoofdstuk C volledig van koers veranderd en focussen we ons op het gedrag van FLT3 als membraaneiwit. De start van het voorgestelde onderzoek werd gegeven door twee observaties in de literatuur: de invloed van oncogene mutaties in AML op de subcellulaire localisatie van de receptor enerzijds, en de observatie van een ligand-gemedieerde resistentie van tyrosine-kinase-inhibitoren
(TKIs) anderzijds. Hoewel deze laatste duidelijk gedocumenteerd is voor alle huidige veelbelovende TKIs, en reeds is gecorreleerd met het falen van twee TKIs in klinische studies, lijken zowel de academische wereld als de farmaceutische industrie tot nog toe weinig belang te hechten aan dit onverklaarde fenomeen.
Onze preliminaire resultaten van flow cytometrie-experimenten bevestigen dat membraanexpressie van een oncogene FLT3 variant, FLT3D835Y, enkel dat van het wild-type niveau bereikt in aanwezigheid van een TKI. Verrassend genoeg blijkt inhibitie met deze inhibitor slechts weinig effect
te hebben op het ligand-gemedieerde internalisatiegedrag van de receptor. Er wordt geargumenteerd dat als internalisatie van de receptor een oorzakelijk gevolg is van zijn activatie, een constitutief geactiveerde receptor een internalisatiesignaal uitzendt nog voor deze het plasmamembraan heeft bereikt. Bijgevolg zal inhibitie van de autofosforylatie de normale cellulaire translocatiemechanismen herstellen, waardoor membraanexpressie van deze receptor wordt verhoogd. Aan het celmembraan wordt deze receptor echter blootgesteld aan stimulatie door het ligand, die de TKI wegconcurreert ten
voordele van een activatie van de receptor.
Dat de voorgestelde hypothese mogelijks vergaande gevolgen kan hebben voor de wijze waarop FLT3 gericht geïnhibeerd wordt in een klinische context, wordt uitvoerig besproken in de discussie van Hoofdstuk C. Tot slot sluiten we dit doctoraatsonderzoek af met mogelijke strategieën die toelaten de huidige generatie TKIs toch te blijven gebruiken als supplement in een chemotherapeutische behandeling.