Project

Flow Cytometrische fingerprinting voor microbiele kwaliteitsborging

Acroniem
178LA114
Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Promotor
Onderzoeksdisciplines
  • Engineering and technology
    • Environmental microorganism biotechnology
Trefwoorden
flow cytometrische fingerprinting microbiële gemeenschappen
 
Projectomschrijving

Bacteriën zijn wijdverspreid op aarde en vormen complexe gemeenschappen waar verschillende genotypen en fenotypen samenleven. Die gemeenschappen zijn belangrijk voor onze moderne samenleving omdat veel verschillende industriële toepassingen door bacteriën worden bewerkstelligd. Die toepassingen gaan van de productie van fijnchemicaliën, farmaceutische producten, en voeding tot het opzuiveren van afvalwater, bioremediatie, bioaugmentatie, en bioleaching. In de toekomst zal het belang van dergelijke technologieën toenemen door de ecologische, economische en technologische voordelen die hen kenmerken. Microbiële gemeenschappen zijn het product van de complexe interacties van bacteriën onderling en van de bacteriën met hun omgeving. Ze zijn dusdynamisch en reageren snel op externe veranderingen waardoor ze ook goede indicatoren zijn voor tot dusver onopgemerkte veranderingen. Een voorbeeld hiervan is de kwaliteitsborging van water die berust op de aan- of afwezigheid van bepaalde microbiële indicatororganismen. Om biotechnologische processen te kunnen verbeteren of om microbiële gemeenschappen te kunnen monitoren voor kwaliteitsborging, is een techniek die de microbiële gemeenschappen kan karakteriseren noodzakelijk. Tijdens dit doctoraatsonderzoek heeft men onderzocht hoe flow cytometrie hiervoor kan worden gebruikt. Bestaande fingerprinting methoden werden verbeterd en de gevoeligheid van de methode voor het karakteriseren van microbiële gemeenschappen werd bepaald. Omdat flow cytometrie berust op het kleuren van de cellen en omdat die kleuring de resolutie en de snelheid van de methode verminderen, heeft men een kleurenvrij alternatief, nl. Raman spectroscopie, onderzocht voor het karakteriseren van microbiële gemeenschappen. Bacteriën zijn erg klein en fluorescente kleurstoffen zijn nodig om ze detecteerbaar te maken voor flow cytometrie. Het type kleurstof is cruciaal voor flow cytometrie en de fingerprinting algoritmen omdat enkel die gekleurde eigenschappen worden belicht. In Hoofdstuk 2 heeft men verschillende ‘multicolor’protocollen met elkaar vergeleken om de fysiologische informatie van de fingerprints te verhogen. Een van de belangrijkste bevindingen is dat ‘multicolor’kleurstoffen vaak niet voldoende stabiel zijn voor fingerprinting en dat SG en SGPI de meest geschikte kleurstoffen zijn. In de rest van dit werk werd dan ook steeds voor deze kleurencombinaties gekozen. In Hoofdstuk 3 heeft men de mogelijkheden van flow cytometrische fingerprinting uitgebreid door de similariteit te berekenen tussen de fingerprints. Om de gevoeligheid van de methode te testen werden 29 verwante Lactobacillus species en stammen vergeleken. De resultaten gaven aan dat 27 van de 29 species en stammen van elkaar konden worden onderscheiden.Met een combinatie van verschillende micropartikels en met een combinatie van verschillende soorten bacteriën werd de gevoeligheid van de methode geschat tussen de 1% à 5% veranderingen in de fingerprints. Mits een gestandaardiseerd groeiprotocol is de methode tevens reproduceerbaar. De gevoeligheid van de methode voor de fysiologische veranderingen tijdens de groei werd geïllustreerd door een cultuur op te volgen in de tijd. Om te kunnen verklaren welke fysiologische veranderingen aan de basis liggen van een veranderde fingerprint in functie van de groeifasen werd in Hoofdstuk 4 een E. coli batch fermentatie opgevolgd met flow cytometrie. De resultaten toonden aan dat de fingerprints veranderden op het moment dat het substraat op was. Die fenotypische switch werd eerder waargenomen dan de veranderingen gemeten door conventionele methoden zoals gas analyse. Verder heeft men met een contrastanalyse kunnen aantonen dat de gevoeligheid van de nucleïnezuurkleurstoffen voor kleine veranderingen in de samenstelling van de nucleïnezuren verantwoordelijk is voor de gevoeligheid van methode. Het gebruik van kleurstoffen voor het detecteerbaar maken van bacteriën vermindert de fysiologische informatie in de fingerprints en Raman spectroscopie werd verder onderzocht als kleuringsonafhankelijk alternatief (Hoofdstuk 5). Verschillende dataverwerkingsalgoritmen werden vergeleken en resultaten hebben aangetoond dat zowel met een supervised als met een unsupervised algoritme de genotypische en fenotypische verschillen tussen populaties accuraat konden worden waargenomen. Daarenboven heeft men een algoritme voorgesteld om op basis van het gemiddelde spectrum van een gemeenschap de species binnen de gemeenschap te kwantificeren. De resultaten waren succesvol maar verschillend afhankelijk van de bacteriën in de gemeenschap. Om de gevoeligheid en complementariteit van flow cytometrie en Raman spectroscopie te bepalen, werd een experiment met vereenvoudigd ecosysteem opgesteld (Hoofdstuk 6). Bacteriën die samen werden opgegroeid pasten hun fenotypen aan maar elk op een andere manier. Dit werd waargenomen door zowel flow cytometrie als Raman spectroscopie en de combinatie van beiden methoden bevestigde de waarnemingen hetgeen de complementariteit van beide illustreert. Bacteriën zijn een belangrijk onderdeel van waterkwaliteit. Om gezondheidsrisico’ te verminderen worden desinfectantia gebruik in het drinkwater distributienetwerk. Omdat de bacteriën nooit helemaal kunnen worden verwijderd, is een goede monitoring van de microbiële gemeenschap in het distributie netwerk noodzakelijk. In Hoofdstuk 7 heeft men de fingerprints van de planktonische microbiële gemeenschap vergeleken met de fingerprints van de microbiële gemeenschap in de biofilms die verondersteld is de belangrijkste fractie bacteriën te bevatten in het drinkwaternetwerk. Resultaten toonden aan dat zowel het type leidingmateriaal als de bron en productie methode van het water een rol spelen in de vormgeving van de microbiële gemeenschap in het water en de biofilms. Nochtans kon er geen verband worden vastgesteld tussen de fingerprints van de biofilms en het bulk water. Verder heeft men ook aangetoond dat Enterobacter amnigenus, een typische drinkwatercontaminant, biofilms kon koloniseren ongeacht het type leidingmateriaal. Indien geautoclaveerd water gebruikt werd, groeiden de Enterobacter beter. Wellicht door necrotrofische groei of door een gebrek aan concurrerende bacteriën. In Hoofdstuk 8 heeft men de gevoeligheid van flow cytometrische fingerprinting getest door elementen toe te voegen aan het water die door de aquatische microbiële gemeenschap als substraat kon worden gebruikt. Dit heeft aangetoond dat de methode voornamelijk gevoelig is voor (her)groei van de microbiële gemeenschap en dat die voornamelijk door koolstof tot stand wordt gebracht. Finaal heeft men met een online flow cytometer een industrieel waterproductiecentrum gemonitord om te illustreren hoe flow cytometrie als vroege indicator voor kwaliteitsborging kan worden gebruikt. Het water werd gestest na verschillende stappen in het proces en men heeft aangetoond dat ook na filtratie (UF of RO) bacteriën aanwezig zijn in het water. De bacterie concentratie was afhankelijk van het type filter, de leeftijd en de manier waarom het water productie centrum bestuurd werd. In dit doctoraatsonderzoek kom men aantonen dat flow cytometrische fingerprinting een geschikte methode is voor het karakteriseren van microbiële gemeenschappen en dat het correleert met zowel genotypische als fenotypische veranderingen in de microbiële gemeenschap. De snelheid en automatisatie van de methode maken het reeds geschikt voor industriële toepassingen zoals voor het monitoren van bioreactoren of het bewaken van microbiële kwaliteit in een waterdistributienetwerk. Raman spectroscopie is een alternatieve methode die mogelijks krachtiger is omdat het moeiteloos genotypen en fenotypen kan onderscheiden. Echter, Raman spectroscopie kan nog niet worden geautomatiseerd en meer onderzoek is noodzakelijk eer het gebruikt kan worden voor industriële toepassingen. Maar de mogelijkheid om tegelijk de taxonomische en fenotypische samenstelling van een microbiële gemeenschap te bepalen in slechts enkele uren maakt deze methode uiterst geschikt voor onderzoek.