Helicobacter pylori is de meest voorkomende gastrale Helicobacter species die van nature de
maag van de mens koloniseert en geassocieerd wordt met gastritis, maagulcera en maagkanker.
Deze Gram-negatieve, microäerofiele bacterie is zeer goed aangepast aan zijn gastheer en
koloniseert de maag van meer dan 50% van de bevolking wereldwijd. Naast H. pylori, die er
uitziet als een licht gebogen staafje, kunnen er ook langere, spiraalvormige helicobacters
aangetroffen worden in de maag van mensen. Deze zogenaamde niet-H. pylori Helicobacter
species (NHPH) zijn afkomstig van dieren en werden reeds geassocieerd met gastritis,
maagulcera en mucosa-geassocieerde-lymfoïd-weefsel (MALT) lymfomen bij de mens.
Bovendien is het risico op het ontwikkelen van MALT-lymfomen hoger na een infectie met
gastrale NHPH dan met H. pylori. NHPH omvatten een groep van nauwverwante maar
verschillende Helicobacter species die worden teruggevonden in verschillende diersoorten. Zo
koloniseren H. felis, H. salomonis, H. bizzozeronii, H. heilmannii sensu stricto (s.s.), H.
cynogastricus en H. baculiformis de maag van hond en kat, terwijl H. suis voornamelijk wordt
teruggevonden in varkens. Gastrale NHPH zijn bijzonder moeilijk te kweken in het
laboratorium, waardoor er wereldwijd maar weinig in vitro isolaten beschikbaar zijn.
H. heilmannii s.s. werd in 2011 voor het eerst succesvol geïsoleerd uit kattenmagen en in vitro
in cultuur gebracht. Dit doctoraatsonderzoek had tot doel om een beter inzicht te verwerven in
de pathogenese van maaginfecties met H. heilmannii s.s., om de mogelijke virulentiefactoren
van H. heilmannii s.s. in kaart te brengen en om het repertoire aan buitenste membraanproteïnen
van deze kiem te vergelijken met deze van andere gastrale Helicobacter species.
In hoofdstuk 1 werden de kiem-gastheer interacties in vivo bestudeerd voor negen
verschillende H. heilmannii s.s. stammen, die geïdentificeerd werden op basis van de sequentie
van hun 16S rRNA en ureAB genen. Hierbij werd gebruik gemaakt van een Mongools
gerbilmodel. Negen weken na de experimentele infectie werd nagegaan in welke mate deze
stammen de maag konden koloniseren. Ook de intensiteit van de geïnduceerde gastritis, de mate
van epitheliale celproliferatie en het expressieniveau van het peptide-hormoon gastrine werden
bestudeerd. De immuunrespons werd gekarakteriseerd door de expressieniveaus van
verschillende inflammatoire cytokines te meten.
Na infectie met zeven van de negen H. heilmannii s.s. stammen ontwikkelden de gerbils een
chronische, actieve gastritis, die voornamelijk in het antrum van de maag teruggevonden werd.
Bij histologisch onderzoek van dit deel van de maag werden lymfocytaire aggregaten en een
hoger aantal prolifererende epitheelcellen gedetecteerd. Deze effecten werden niet
waargenomen bij de twee overige stammen. In de fundus werden er enkel beperkte tekenen van
inflammatie opgemerkt na een infectie met elk van de negen H. heilmannii s.s. stammen. In
deze regio van de maag werd er ook geen verhoogde epitheliale celproliferatie waargenomen.
Met kwantitatieve PCR werd er een hoge kolonisatiegraad aangetoond in het antrum van de
maag na infectie met vier H. heilmannii s.s. stammen. De kolonisatiegraad van vier andere
stammen was eerder beperkt en één stam kon niet gedetecteerd worden op negen weken na de
experimentele infectie. Het kolonisatieniveau was voor alle stammen hoger in het antrum dan
in de fundus van de maag en in het duodenum werd het laagste aantal bacteriën gedetecteerd.
Een verlaagde expressie van het waterstof-kalium (H+ /K+ ) ATPase - een protonpomp in de
maagzuur-producerende pariëtale cellen - kon enkel gedetecteerd worden in de antrale regio
van de maag na infectie met drie H. heilmannii s.s. stammen die de maag in hoge mate
koloniseerden. Dit zou kunnen wijzen op een verlies aan pariëtale cellen en een gereduceerde
maagzuursecretie. Er werd echter geen verlaagde expressie van het H+ /K+ ATPase aangetoond
in de fundus van de maag, waar de meeste zuur-secreterende pariëtale cellen gelocaliseerd zijn.
Daarnaast veroorzaakten twee sterk koloniserende H. heilmannii s.s. stammen ook een
verhoogde expressie van het peptide-hormoon gastrine in de fundus regio. Dit zou kunnen
leiden tot een hypergastrinemie. De gastrine-producerende G-cellen zijn echter hoofdzakelijk
gelocaliseerd in het antrale gedeelte van de maag, waar geen verhoogde gastrine-expressie werd
gedetecteerd.
De H. heilmannii s.s. stammen die geassocieerd werden met een chronische, actieve gastritis,
veroorzaakten een stijging van IL-1β in het antrum van de maag. Dit pro-inflammatoire
cytokine is een krachtige remmer van de maagzuursecretie en speelt een rol in de acute fase van
inflammatie. Er werd geen verhoogde expressie van T helper (Th)1 of Th2 cytokines
gedetecteerd in de maag van de gerbils die geïnfecteerd waren met H. heilmannii s.s.
In deze studie konden er duidelijke verschillen in kiem-gastheer interacties en virulentie worden
vastgesteld tussen de negen verschillende H. heilmannii s.s. stammen. Op basis van het
kolonisatieniveau en de graad van inflammatie in het antrum van de maag, werden vijf stammen
geclassificeerd als hoog-virulent en vier stammen als laag-virulent. Aangezien het Mongools
gerbilmodel wordt beschouwd als een goed model voor Helicobacter-gerelateerde
maagpathologie bij de mens, kan er besloten worden dat deze stamverschillen
hoogstwaarschijnlijk ook relevant zijn voor humane infecties met H. heilmannii s.s. Deze
stamverschillen zouden ook van belang kunnen zijn voor infecties bij de natuurlijke gastheer.
In hoofdstuk 2 werd onderzocht of de verschillen in kolonisatie en virulentie tussen de negen
H. heilmannii stammen gerelateerd konden worden aan de aanwezigheid of afwezigheid van
specifieke virulentie-geassocieerde genen. Hiertoe werden de genomen van alle stammen
gesequeneerd en geanalyseerd. Daarnaast werden in vitro bindingstesten uitgevoerd om
verschillen in bindingscapaciteit aan de maagmucosa in kaart te brengen.
Op basis van fylogenetische analyse werd er aangetoond dat de laag-virulente isolaten niet
behoren tot de species H. heilmannii, maar tot een nieuwe, nauwverwante species die H.
ailurogastricus werd genoemd. Deze nieuwe Helicobacter species kon niet onderscheiden
worden van H. heilmannii op basis van de 16S rRNA en ureAB gensequenties. Ook
morfologisch zijn beide species zeer gelijkend. Het enige verschil is dat H. heilmannii een hoger
aantal spiraalvormige windingen vertoont en meer bipolaire flagellen bezit dan H.
ailurogastricus. De biochemische kenmerken zijn eveneens zeer gelijkaardig, met als enige
verschil dat H. ailurogastricus alkalische fosfatase-activiteit vertoont, terwijl dit afwezig is in
H. heilmannii.
Verschillende homologen van virulentiefactoren van H. pylori werden teruggevonden in H.
heilmannii, maar niet in H. ailurogastricus. Tot deze homologen behoren het ulcergeassocieerde eiwit IceA1, het HrgA eiwit dat deel uitmaakt van een DNA restrictiemodificatie-systeem en een jhp0562-like glycosyltransferase dat betrokken is bij immuunevasie en bij de ontwikkeling van maagzweren. Deze factoren dragen mogelijk bij tot het meer
virulente karakter van H. heilmannii in vergelijking met H. ailurogastricus.
Proteomische analyses toonden aan dat zowel H. heilmannii als H. ailurogastricus, net zoals
H. pylori, beschikken over een groot repertoire aan buitenste membraanproteïnen (‘outer
membrane proteins’, OMPs). Beide species beschikken echter maar over enkele homologen
van de Hop, Hor en Hom eiwitten van H. pylori. Alle beschreven adhesines van H. pylori zijn
zelfs afwezig in beide species. H. heilmannii beschikt over zes putatieve OMPs die afwezig zijn
in H. ailurogastricus. Deze OMPs zijn interessant voor verder onderzoek, aangezien ze een
potentiële rol kunnen spelen in het kolonisatieproces van H. heilmannii.
Daarnaast werd ook een homoloog van de ‘VacA-like’ autotransporter van H. pylori
teruggevonden in zowel H. heilmannii als H. ailurogastricus. Deze autotransporter verhoogt de
capaciteit om de maag te koloniseren. Het ‘passenger’ domein van de ‘VacA-like’
autotransporter van H. pylori, dat de effectorfunctie uitvoert, bevat drie VacA2 regio’s. De
‘passenger’ domeinen van de ‘VacA-like’ autotransporters van de H. heilmannii stammen
bevatten eveneens drie VacA2 regio’s, terwijl dit domein bij de H. ailurogastricus stammen
vier VacA2 regio’s omvat. Aangezien H. ailurogastricus in vivo een lagere capaciteit vertoont
dan H. heilmannii om de maag te koloniseren, zou de grootte van het ‘passenger’ domein een
mogelijke rol kunnen spelen in het kolonisatieproces.
De verschillen tussen H. heilmannii en H. ailurogastricus met betrekking tot de mogelijkheid
tot kolonisatie in vivo, reflecteerden zich ook in hun in vitro capaciteit om te adhereren aan de
maagmucosa. H. heilmannii lijkt gemakkelijker te binden aan humane maagmucines dan H.
ailurogastricus en heeft een duidelijk hogere bindingscapaciteit aan maagepitheelcellen.
Daarnaast bindt H. heilmannii voornamelijk aan de klieren van zowel het antrum als de fundus
van de maag, terwijl H. ailurogastricus eerder bindt aan de epitheelcellen die het
maagslijmvlies bekleden.
Samengevat beschreven we in de tweede studie de nieuwe gastrale H. ailurogastricus species,
afkomstig van katten, die nauwverwant is aan H. heilmannii s.s. H. ailurogastricus heeft echter
een lagere in vitro capaciteit om te binden aan maagepitheelcellen en mist verschillende
factoren die een rol spelen in virulentie en kolonisatie. Dit zou kunnen verklaren waarom deze
nieuwe species minder virulent is dan H. heilmannii.
De buitenste membraan van H. pylori is uitgerust met een groot aantal OMPs en verschillende
van deze eiwitten zijn betrokken bij het koloniseren van de humane maagmucosa. Voor H.
heilmannii, H. ailurogastricus en andere gastrale NHPH is er echter weinig gekend over welke
OMPs een rol spelen in het kolonisatieproces. Alle belangrijke Hop adhesines van H. pylori
zijn afwezig in deze species. Dit impliceert dat zij andere OMPs gebruiken om te adhereren aan
de maagmucosa.
In hoofdstuk 3 van deze thesis werd het OMP-repertoire van gastrale NHPH gekarakteriseerd
op basis van fylogenetische analyses en werden de OMP-families die mogelijks betrokken zijn
in kolonisatie en virulentie geïdentificeerd. We toonden aan dat gastrale NHPH, net zoals H.
pylori, beschikken over proportioneel meer OMPs dan andere Gram-negatieve bacteriën. Dit
zou het gevolg kunnen zijn van een aanpassing aan de zure omgeving in de maag. Er werden
verschillende OMP-families met een mogelijke functie in kolonisatie of virulentie
geïdentificeerd in gastrale NHPH. Deze families zijn ook aanwezig in Campylobacter, E. coli
en enterohepatische helicobacters en omvatten de 1) TonB-afhankelijke receptoren met een
functie in ijzeropname, 2) een buitenste membraan factor betrokken in antimicrobiële resistentie
en 3) een buitenste membraan fosfolipase dat een rol speelt in kolonisatie. Een Imp/OstA
porine, betrokken in antimicrobiële resistentie, was geconserveerd in de genera Campylobacter
en Helicobacter. Daarnaast werden er enkel in Helicobacter verschillende OMP-families
gedetecteerd en dit voornamelijk in gastrale species. Deze families omvatten SfpA/LpxR dat
een rol speelt in immuun-evasie, twee Helicobacter-specifieke buitenste membraan porine
families met mogelijke functies in adhesie, en een Helicobacter-specifiek ‘VacA-like’
cytotoxine (gekarakteriseerd in hoofdstuk 2) met een rol in kolonisatie. Het grootste deel van
alle OMPs van gastrale NHPH clusterden in de twee Helicobacter-specifieke porine families.
De eerste porine familie omvatte het grootste aantal OMPs, waaronder ook de Hop adhesines
van H. pylori die afwezig zijn in NHPH, behalve in H. acinonychis en H. cetorum. De Hor,
Hom en andere Hop OMPs van H. pylori behoren ook tot deze porine familie, en een aantal
homologen van deze eiwitten waren ook aanwezig in andere gastrale NHPH. Een laatste
subgroep van deze familie bevatte putatieve OMPs die specifiek zijn voor NHPH van hond, kat
en varken. De combinatie van een uniek repertoire aan porines en de afwezigheid van de H.
pylori Hop adhesines wijst erop dat gastrale NHPH andere OMPs gebruiken om de
maagmucosa te koloniseren en dat hun pathogenese verschillend is van H. pylori.
De tweede Helicobacter-specifieke porine familie was samengesteld uit de acht Hof OMPs van
H. pylori. Deze Hof eiwitten zijn sterk geconserveerd in gastrale NHPH. Echter, in tegenstelling
tot H. pylori zijn de hof genen van NHPH gelocaliseerd in één grote unieke genlocus. De functie
van de meeste Hof eiwitten zijn op dit moment ongekend. Enkel voor HofE en HofF werd reeds
aangetoond dat ze betrokken zijn in kolonisatie van de maag.
Interessant voor ons onderzoek is dat er verschillende species-specifieke OMP-families werden
gevonden in NHPH van hond en kat die afwezig zijn in andere Helicobacter species. De functie
en het belang van deze putatieve eiwitten moet echter nog worden onderzocht.
In deze thesis toonden we aan dat H. heilmannii s.s., geïsoleerd uit de maag van katten, in staat
is om inflammatie te induceren in de maag van Mongoolse gerbils, een in vivo model voor
humane maagpathologie. Daarnaast beschreven we de nieuwe species H. ailurogastricus, die
nauwverwant is aan H. heilmannii. Met behulp van zowel in vitro als in vivo studies toonden
we aan dat H. ailurogastricus minder virulent is dan H. heilmannii. Er werden verschillende
virulentie-geassocieerde factoren geïdentificeerd in H. heilmannii die mogelijks bijdragen tot
het verschil in pathogeniciteit tussen deze twee Helicobacter species. Ten slotte werd het OMPrepertoire van alle gastrale NHPH gekarakteriseerd, wat van grote waarde kan zijn voor
toekomstige in vitro en in vivo kolonisatiestudies.