Nanotechnologie is één van de drijfveren achter vele technologische ontwikkelingen in de
21ste eeuw. Vele anorganische en organische materialen vertonen immers unieke
eigenschappen op nanoscopische schaal, hetgeen de deur opent naar nieuwe innovatieve
producten. Op medisch vlak, worden organische nanopartikels (NPs) veelal gebruikt as
dragers voor weinig oplosbare moleculen of marcomoleculen, zoals nucleïne zuren (NZ).
Deze laatste groep wordt verpakt in nanoscopische dragers om transport tot zijn doelwit
orgaan en opname in de cel te bewerkstelligen zonder verlies van NZ functie. In deze context
werden zowel virale als niet-virale dragers in parallel ontwikkeld. Niet-virale dragers worden
als relatief veilig beschouwd maar worden gekenmerkt door een beperkte transfectie
efficiëntie door vele extra- en intracellulaire barrières die een efficiënte NZ aflevering
belemmeren. Endosomale ontsnapping van de NZ wordt beschouwd als het belangrijkste
intracellulaire knelpunt. Zelfs ingeval van transfectie met zeer efficiënte dragers, kan slecht
een beperkte fractie van de NZ cargo in het cytoplasma afgeleverd worden. Het leeuwendeel
van de NZ cargo wordt immers naar de lysosomen geleid, waar ze ten prooi vallen van
degraderende enzymen. Om deze afbraak te voorkomen, focussen de meeste recente
strategieën op het vermeiden van de lysosomen door vrijstelling van de NZ vanuit de vroege
of late endosomen te faciliteren. In tegenstelling tot deze algemene trend, ontwikkelden wij
een methode om NZ vrijstelling vanuit de lysosomen te bekomen. Meer specifiek, trachtten
we om de afgifte van klein interfererend (si)RNA na transfectie met nanogelen (NG) te
bevorderen met behulp van kationische amfifiele geneesmiddelen, meer specifiek
functionele inhibitoren van het zure sphingomyelinase (FIASMAs). In Hoofdstuk 1 werden
siRNA, NZ aflevering met behulp van NG en het gebruik van FIASMAs als adjuvans uitgediept.
Initieel werd plasmide (p)DNA afgeleverd via liposomale formulaties. Sinds het gebruik van
deze methode werd geëxperimenteerd met adjuvantia om de pDNA afleveringsefficiëntie te
verhogen. In Hoofstuk 2 werden zowel de initiële als recente studies belicht die gebruik
maken van een adjuvans strategie. Bepaalde adjuvantia verbeteren de penetratie van de
drager in de tumor, terwijl de cellulaire opname eveneens verbeterd kan worden. Enkele
andere moleculen zullen specifiek de endosomale vrijstelling verbeteren, interfereren met
de intracellulaire verdeling of rechtstreeks de transgen expressie van het afgeleverde pDNA
stimuleren. Twee bijkomende klassen van ajduvantia kunnen de immuun respons reduceren
of pDNA translocatie naar de kern begunstigen. Finaal, zijn er bepaalde pleiotrope
moleculen (chloroquine, dexamethason en andere steroïden) die simultaan verschillende
processen beïnvloeden. Dit overzicht toont duidelijk de diversiteit van de adjuvans strategie
aan hoewel het effect van bepaalde adjuvantia sterk afhangt van het NZ, de drager en het
moment van toediening ten opzichte van de transfectie. Verdere inzichten in opname,
intracellulaire verdeling en endosomale vrijstelling zullen in de toekomst toelaten om
rationeel adjuvantia, NZ en dragers te combineren.
In Hoofdstuk 3 werd aangetoond dat FIASMAs de accumulatie van fosfolipiden, cholesterol
en sphingomyeline induceren. Deze kortstondige inductie van een fosfolipidosis fenotype
zou vervolgens de stabiliteit van de lysosomale membraan verminderen, waardoor siRNA
kan worden vrijgesteld in het cytosol. De vooropgestelde verbeterde afgifte van siRNA naar
het cytosol zorgde op zijn beurt voor een sterke verhoging van het therapeutisch potentieel
van de siRNA-beladen NG. Verder toonden we aan dat de lysosomen als depot voor
gestimuleerde en verlengde siRNA vrijstelling konden dienen. In Hoofdstuk 4 werd de
bredere toepasbaarheid van de FIASMA adjuvans methode bestudeerd. Ten eerste
bemerkten we dat een molecule die fosfolipidosis induceert, niet noodzakelijk een
functioneel adjuvans is. Verder kunnen bepaalde moleculen de lysosomale membraan
mogelijkst te sterk beschadigen waardoor verhoogde siRNA vrijstelling gepaard gaat met
cytotoxiciteit. Verder kon de vrijstelling van mRNA niet in een zelfde mate verbeterd worden
en waren lipide-gebaseerde transfectie methoden minder gevoelig voor het FIASMA effect.
Samengevat, hebben we aangetoond dat FIASMAs het therapeutisch potentieel van siRNAbelanden NG sterk verhogen maar dat dit effect zowel drager- als NZ-afhankelijk is. Een
volgende stap in dit onderzoek is mogelijks het aanduiden van meer potente adjuvantia met
behulp van een grootschalige screening. Verder kan de opheldering van het mechanisme
waardoor de FIASMAs siRNA aflevering verbeteren uitsluitsel geven over voor welke NZ en
dragers deze methode toepasbaar is. Een laatste element dat verder onderzoek vergt is de
co-inclusie van zowel het adjuvans als het NZ in eenzelfde drager of de synthese van
adjuvans-NZ conjugaten.
Naast het gebruik van organische nanoscopische dragers, worden mogelijke biomedische
toepassingen van inorganische NPs uitgebreid bestudeerd. Bepaalde NPs kunnen immers
toegepast worden om bestaande detectiemethoden of therapieën te verbeteren of om
nieuwe biomedische applicaties te ontwikkelen. Ijzer oxide (IO)NPs kunnen bijvoorbeeld
gebruikt worden in magnetisch-geleide aflevering van medicijnen, beeldvorming met
magnetische resonantie en de bestrijding van kanker via hyperthermie. Ondanks de vele
proof-of-concept studies worden slecht weinig anorganische NPs klinisch toegepast. Dit is in
grote mate te wijten aan de onzekere veiligheid van anorganische NPs door de vele
contradictorische resultaten van nanotoxiciteitsstudies. In Hoofdstuk 5 werden NPinteracties op celniveau besproken die tot nanotoxiciteit kunnen leiden. Verder werden de
meest gebruikte in vitro methoden en hun tekortkomingen aangehaald. Nieuwe methoden
werden geïntroduceerd en we toonden aan dat de complexiteit van het in vitro cel model de
NP opname en toxiciteit beïnvloed, hetgeen het belang van optimalisatie en standaardisatie
van in vitro methoden benadrukt.
In Hoofdstuk 6 bestudeerde we hoe IONPs interageren met zes neuronale celtypes, namelijk
humane en muriene neuronale stam cellen (NSC), een geïmmortaliseerde neuronale
progenitor cellijn en een neuroblastoma kankercellijn. Naast species-specifieke variaties,
bemerkten we dat de kanker cellijn en NSC respectievelijk het minst en meest uitgesproken
reageerden op de IONPs. Meer nog, elk celtype vertoonde een uniek toxiciteitsprofiel
waarbij de mate en het type effect verschilden. Hieruit blijkt dat een enkel eindpunt
onvoldoende informatie biedt omtrent de in vitro nanotoxiciteit. Vervolgens (Hoofdstuk 7)
rapporteerden we hoe het celtype de optimalisatie van NPs kan beïnvloeden. Hoewel de
DMSA-gecoate IONPs in het algemeen minder toxisch bleken dan de PMA-gecoate IONPs
werd in elk celtype opnieuw een uniek nanotoxiciteitsprofiel bekomen. Daarom is het
belangrijk om een celmodel te gebruikten dat de doelwitcel zo dicht mogelijk benaderd.
In het algemeen zou de optimalisatie en standaardisatie van in vitro nanohazard evaluaties
de kwaliteit van nanotoxiciteisonderzoek sterk bevorderen. Hierdoor zou eveneens de
klinische toepassing van NPs een boost kunnen krijgen. Naar analogie met richtlijnen
omtrent in vivo experimenten, zouden regulatoren een consensus moeten bieden over hoe
nanotoxiciteit in vitro geëvalueerd dient te worden. In dit werk hebben we aangetoond dat
het celmodel een belangrijke invloed heeft en dat deze factor niet vergeten mag worden in
de optimalisatie en standaardisatie. Daarnaast dienen bruggen gebouwd te worden tussen
in vitro toxiciteitseindpunten en in vivo waarnemingen aangezien dit zou betere extrapolatie
toelaten naar mogelijke nadelige effecten in de mens.