Project

Assemblage en optimalisatie van synthetische pathways in Saccharonmyces cerevisiae: aurones als case study

Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Medical and health sciences
    • Laboratory medicine
    • Laboratory medicine
    • Laboratory medicine
Trefwoorden
Saccharomyces cerrevisiae: aurones Flovonoïden Gist
 
Projectomschrijving

De industriële of witte biotechnologie die gebruik maakt van micro-organismen en enzymen voor de productie van industrieel relevante verbindingen is de laatste jaren aan
een opmars bezig. Een interessante groep van verbindingen hiertoe zijn flavonoïden, secundaire plantmetabolieten met veelbelovende bioactieve eigenschappen voor behandelingen tegen virale en bacteriële infecties, kanker en ontstekingen. Bijgevolg krijgen deze moleculen bijzondere aandacht voor hun gebruik in de gezondheidssector. Het is dus essentieel om deze componenten op een duurzame manier en in voldoende
hoeveelheden te voorzien. De huidige productie van deze moleculen heeft enkele inherente nadelen zoals de lage opbrengst na extractie uit planten en de meerdere reactiestappen, brute reactiecondities en de bijkomende moeilijkheid van chirale centra bij chemische
synthese. De productie van deze hoogwaardige secundaire metabolieten met behulp van micro-organismen is dan ook een valabel alternatief. Echter, de ontwikkeling van geschikte
microbiële stammen met een rendabele productietiter is een hele uitdaging, zeker door de moeilijkheid van het afstemmen van alle stappen in een (heterologe) pathway en het natieve
metabolisme. In dit opzicht hebben recente technieken uit het veld van de synthetische biologie en metabolic engineering er wel voor gezorgd dat dit proces deels vereenvoudigd
werd. Desondanks blijft het nog altijd een kost – en arbeidsintensieve onderneming, en niet in het minst in het eukaryoot gastheerorganisme Saccharomyces cerevisiae. Daarom is het doel van dit doctoraatsonderzoek om nieuwe technologieën te ontwikkelen die het wijzigen van genexpressie op transcriptie – en translatieniveau vergemakkelijkt en als dusdanig de constructie van gist productiestammen versnelt. Met het belang van flavonoïden voor de gezondheidssector werd dit toegepast voor de productie van naringenine als proof of concept.
Het gebruik van gekarakteriseerde, modulaire regulerende DNA sequenties en het delen van biologische data op een gestandaardiseerde manier zijn essentieel voor de
transformatie van het synthetische biologie veld naar een volwaardige engineering discipline. In dat opzicht vormt de vage afbakening van transcriptionele en translationele controle elementen in gist een hinderpaal om dit transformatieproces in eukaryoten te versnellen. Om dit aan te pakken werden nieuwe biologische regulatoren ontwikkeld die enerzijds een effect hadden op transcriptie, i.e. semisynthetische core promotoren, en anderzijds een effect hadden op translatie, i.e. 5’UTRs met een voorspelbare invloed op genexpressie. De core promotor in gist heeft de grootste invloed op de transcriptionele
modulatie van een gen waardoor het een interessante target is om bio-synthetische pathways te reguleren. Daarnaast kunnen minimale core promotoren voor gist met gelijke of betere activiteiten dan de bestaande logge natieve promotoren, het assembleren van transcriptie eenheden sterk vergemakkelijken. Bijgevolg werd de goed gekende TEF1
promotor ingekort om de minimale lengte te achterhalen die aanleiding gaf tot voldoende genexpressie. Deze minimale sequentie deed verder dienst als template voor het creëren
van een core promotor bank die verder resulteerde in korte, semisynthetische promotoren die even of zelfs dubbel zo sterk waren als de veelgebruikte lange gist promotoren. Naast
het variëren van transcriptie heeft het aanpassen van de translatie-initiatie, voornamelijk in prokaryoten, reeds zijn nut bewezen als technologie om op een voorspelbare manier
genexpressie te modificeren. Een gelijkaardige methode werd daarom opgezet in S. cerevisiae door de ontwikkeling van een partial least square (PLS) regressiemodel dat 13 5’UTR eigenschappen linkt met eiwitniveaus. Dit model werd verder gebruikt voor de novo design van 5’UTRs met een voorspelbaar effect op genexpressie in verschillende genetische
contexten. In vivo evaluatie van deze 5’UTR sequenties toonde de goeie algemene toepasbaarheid van het model aan, aangezien adequate determinatie coëfficiënten (R²)
bekomen werden in alle experimenten. Dit data-gedreven algoritme draagt zo bij tot de uitbreiding van de eerder beperkte set van bestaande methoden voor de novo design van
biologische regulatoren in gist.
Naast monocistronische regulatie toonden eerdere studies reeds de mogelijkheid aan van multicistronische expressie voor het balanceren van eukaryotische pathways, echter, deze
techniek wordt grotendeels niet gebruikt in S. cerevisiae. Daarom werd deze technologie, gebruik makende van T2A peptide sequenties die zorgen voor ribosoom skipping op het
einde van een coderende sequentie en waarvan aangetoond werd dat ze efficiënt werken in verschillende gist species, grondig geëvalueerd. Het herhaaldelijk gebruik in lange pathways wordt echter verhinderd in bakkersgist door de hoge kans op ongewenste homologe recombinatie. Om dit te vermijden werden vijf T2A sequenties gemaakt die zoveel mogelijk verschilden in hun onderlinge nucleotide sequentie en verder werden deze geëvalueerd op hun effectiviteit als een regulerend element voor pathway optimalisatie. De T2A peptiden, met uitzondering van één T2A peptide met een wat lagere betrouwbaarheid, leidden effectief tot gesplitste eiwitten. Finaal werd voor bi-, tri- en quadcistronische constructen in
het genoom getest of 2A peptiden dienst kunnen doen als een echte regulator van genexpressie in een polycistronische pathway. Terwijl alle constructen stabiel geïntegreerd
werden in het genoom en voor bi – en tricistronische expressie acceptabele eiwitniveaus vastgesteld werden, werd er geen expressie waargenomen voor het laatst gepositioneerde
eiwit in de quadcistronische transcriptie-eenheid. Bijgevolg kan geconcludeerd worden dat het gebruik van multicistronische expressie in bakkersgist best beperkt blijft tot bi- en
tricistronische expressie.
Om het vermogen aan te tonen van S. cerevisiae als een industriële gastheer voor de biosynthese van hoogwaardige metabolieten werd het S288c wild-type getransformeerd in
een productiestam voor naringenine. Om dit te verwezenlijken werd gebruik gemaakt van baanbrekende technieken uit de synthetische biologie zoals CRISPR/Cas9 en het veelzijdig
genetische assemblage systeem VEGAS. Het metabolisme van gist werd omgebouwd om de aanvoer van de flavonoïde precursoren fenylalanine, tyrosine en malonyl-CoA te verhogen.
Als eerste werd de verhoogde pool aan fenylalanine en tyrosine indirect geanalyseerd door coumarinezuur te meten na introductie van de coumarinezuur pathway. Daarna werd de
verbeterde pool aan malonyl-CoA in het cytosol geëvalueerd door het analyseren van naringenine titers na introductie van de laatste drie naringenine pathway genen en de stammen te voeden met coumarinezuur. Finaal werden beide optimalisatie methoden gecombineerd in de stammen met de meest belovende metabolische achtergrond om naringenine te produceren vanuit glucose met maximale productiviteit. Aanvaardbare titers tot 4.0 mg/l werden bekomen, echter, om een volledig rendabele productiestam te bekomen zal verdere stamoptimalisatie nodig zijn. Aangezien enkel de natieve precursor pools gemodificeerd werden en nog geen afstelling van de naringenine pathway zelf uitgevoerd werd, lijkt dit laatste de meest aangewezen weg om in de toekomst de finale productietiter te verhogen. Daartoe werd de ontwikkelde design-methode voor 5’UTRs uitgetest voor de voorspelbare expressie van het Rhodobacter capsulatus tal1 gen, dat instaat voor de conversie van tyrosine naar coumarinezuur. De eerste resultaten waren veelbelovend aangezien de coumarinezuur-titers proportioneel waren met de voorspelde enzymniveaus, wat nogmaals het potentieel aantoont van deze technologie voor verdere pathway optimalisatie.
Algemeen werden tijdens dit doctoraatsonderzoek verscheidene technologieën ontwikkeld en geëvalueerd om de toekomstige ontwikkeling en optimalisatie van S. cerevisiae
productiestammen te vergemakkelijken. Specifiek werden korte semisynthetische core promotoren ontwikkeld samen met een methode om betrouwbaar de translatie van een gen
te wijzigen. Daarnaast werd ook de capaciteit nagegaan van 2A peptiden als een regulator voor multicistronische expressie in gist. Aangezien het ontwikkelen van duurzame productieprocessen voor economisch relevante verbindingen een belangrijke missie is van de industriële biotechnologie, werd ook een naringenine productiestam gecreëerd. In zijn
geheel heeft dit Ph.D. onderzoek aangetoond dat S. cerevisiae een interessante gastheer is voor de productie van secundaire metabolieten en heeft het bijgedragen tot de uitbreiding
van synthetische biologie technologieën voor gist. Dit zal in de toekomst bijdragen bij het verder reduceren van ontwikkelingstijden van nieuwe bioprocessen.