Cryopreservatie van gameten en embryo’s vormt een belangrijk onderdeel van de geassisteerde
voortplantingstechnieken omdat het kan gebruikt worden om genetisch materiaal voor langere tijd
te bewaren. De introductie van vitrificatie resulteerde in een veelbelovende techniek voor de
cryopreservatie van eicellen en embryo’s. De capaciteit van eicellen en embryo’s om verder te
ontwikkelen is echter aangetast na het opwarmen. In Hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van
de moeilijkheden die bij de vitrificatieprocedure komen kijken, evenals een beschrijving van de
verschillende variabelen die deze procedure en de invriesbaarheid van eicellen en embryo’s
beïnvloeden.
De algemene doelstelling van deze thesis was om de effectiviteit van de vitrificatie van eicellen en
embryo’s te verbeteren bij het rund en het paard (Hoofdstuk 2). Daartoe hebben we twee variabelen
onderzocht die de vitrificatie beïnvloeden: (1) de aanwezigheid van cumuluscellen rondom de eicel
gedurende de vitrificatie en hun invloed op de invriesprocedure en (2) het effect van eicelrijping in de
aanwezigheid van serum op de vitrificatie van eicellen en blastocysten.
In Hoofdstuk 3 werd specifieke aandacht gegeven aan de rol van cumuluscellen rondom de rijpe
rundereicel tijdens de vitrificatie van deze eicel. Het is reeds geweten dat cumuluscellen een
fundamentele rol spelen tijdens de eicelrijping, de bevruchting en de ontwikkeling van blastocysten.
Ze zouden echter de uitwisseling van water en cryoprotectanten (CPAs) kunnen verhinderen, wat zou
leiden tot onvoldoende bescherming van de eicel tijdens de vitrificatie. Onze resultaten toonden aan
dat de aanwezigheid van meerdere lagen cumuluscellen rondom de eicel een nadelig effect had op
de overleving van deze eicel na vitrificatie. Anderzijds werden na totale verwijdering van de
cumuluscellen gelijkaardige overlevingspercentages geobserveerd bij de gevitrificeerde,
gedenudeerde eicellen en hun verse tegenhangers.
Bij het rund is het geweten dat het verwijderen van cumuluscellen de bevruchtingspercentages van
de eicellen vermindert. Daarom hebben we in onze studie drie verschillende benaderingen gebruikt
om onderscheid te maken tussen ‘vitrificeerbaarheid’ en ‘bevruchtbaarheid’. In eerste instantie
werden gevitrificeerde, gedenudeerde eicellen bevrucht in de aanwezigheid van intacte cumuluseicel-complexen (COCs). In tweede instantie werden eicellen met een corona radiatia (CR) gebruikt
als compromis tussen COCs en gedenudeerde eicellen. Tenslotte werden gevitrificeerde eicellen
parthenogenetisch geactiveerd. Onze resulaten toonden aan dat het verwijderen van cumuluscellen
voor vitrificatie leidde tot een verminderde bevruchting van de gevitrificeerde, gedenudeerde
eicellen. Een interessante bevinding hierbij was dat deze situatie hersteld kon worden wanneer de
gevitrificeerde, gedenudeerde eicellen bevrucht werden in de aanwezigheid van verse COCs. Ten
tweede zagen we dat het verwijderen van de buitenste cumuluslagen op zich (CR eicellen) reeds
resulteerde in een verminderde bevruchting van verse eicellen in vergelijking met eicellen die
omgeven worden door meerdere lagen cumuluscellen. Zo’n effect werd niet gedetecteerd bij de
gevitrificeerde CR eicellen, waarbij de bevruchting en de embryonale ontwikkeling gelijkaardig waren
aan deze van de gevitrificeerde COCs. Verrassend genoeg was de capaciteit om tot blastocyst te
ontwikkelen van gevitrificeerde CR eicellen gelijkaardig aan deze van verse eicellen na
parthenogenetische activatie.
Over het geheel bekeken, tonen onze resultaten duidelijk aan dat de aanwezigheid van
cumuluscellen het binnendringen van CPAs kan verminderen met een minder goede vitrificatie van
rijpe rundereicellen tot gevolg en daarom is het aan te raden om de buitenste lagen cumuluscellen te
verwijderen.
Als cumuluscellen de uitwisseling van CPAs verminderen, zou het gebruik van hogere concentraties
CPAs het binnendringen in de cellen kunnen versnellen. Daarom werden in Hoofdstuk 4 twee
protocollen geëvalueerd (korte blootstelling aan hoge concentraties CPAs en lange blootstelling aan
lagere concentraties CPAs) voor de vitrificatie van onrijpe paardeneicellen, omgeven door enkele
(CR) of meerdere lagen cumuluscellen (COCs). In onze studie zagen we een verminderde eicelrijping
wanneer COCs werden gevitrificeerd door korte blootstelling aan hoge concentraties CPAs. Gelukkig
kon deze situatie hersteld worden door het gebruik van CR eicellen of door blootstelling van COCs
aan lagere concentraties CPAs voor langere tijd. Deze bevindingen ondersteunen onze observaties
van Hoofdstuk 3, waarbij de aanwezigheid van meerdere lagen cumuluscellen rondom de eicel de
beweging van CPAs en water verhindert, waardoor een langere blootstelling nodig is voor een
correcte bescherming.
Bijgevolg werd in de volgende studies niet verder gewerkt met COCs en werden enkel CR eicellen
gebruikt om het effect van twee verschillende protocollen op de spoelfiguur en de embryonale
ontwikkelin van gevitrificeerde onrijpe paardeneicellen na te gaan (Hoofdstuk 4). Onze gegevens
toonden aan dat beide protocollen voor vitrificatie resulteerden in hogere percentages abnormale
spoelfiguren bij de gevitrificeerde eicellen dan bij de verse. Een interessantere bevinding was dat de
ontwikkeling tot blastocyst enkel plaatsvond bij de eicellen die gevitrificeerd waren door middel van
korte blootstelling aan hoge concentraties CPAs. De transplantatie van dergelijke blastocysten
resulteerde in drachten, met uiteindelijk de geboorte van een gezond hengstveulen tot gevolg, op 12
mei 2017, een wereldprimeur. De langere blootstelling aan CPAs die werd gebruikt in het andere
protocol zou kunnen leiden tot toxische effecten die de verdere embryonale ontwikkeling van de
gevitrificeerde eicellen verhinderden.
Deze bevindingen wijzen erop dat naast de aanwezigheid van cumuluscellen ook andere variabelen,
zoals de concentratie CPAs en de blootstellingstijd, van kritiek belang zijn bij de ontwikkeling van een
succesvol protocol voor vitrificatie.
In Hoofdstuk 5 werd nog een andere variabele die de vitrificatie van eicellen en embryo’s beïnvloedt
bestudeerd. Het is geweten dat de aanwezigheid van serum tijdens de cultuur de invriesbaarheid van
eicellen en blastocysten vermindert. In het eerste deel van onze studie hebben we de vitrificatie
onderzocht van rudereicellen na rijping onder twee verschillende omstandigheden: in aanwezigheid
van serum of in afwezigheid van serum maar na toevoeging van epidermale groeifactor (EGF,
Hoofdstuk 5.1). Onze resultaten toonden aan dat bevruchting niet beïnvloed door de
omstandigheden voor eicelrijping, maar was ze drastisch gedaald na vitrificatie. Wanneer de
embryonale ontwikkeling werd bestudeerd in een tweede experiment, zagen we hoe de
aanwezigheid van serum de deling van de gevitrificeerde eicellen verminderde.
Vitrificatie wordt beschouwd als een stressvol proces dat leidt tot de opening van ‘hemichannels’ in
cellen. Hierdoor gaan verschillende moleculen en ionen verloren die van belang zijn voor het
overleven van de cel. Er werd aangetoond dat de toevoeging van een mimetisch connexin peptide
deze ‘hemichannels’ kan sluiten met een betere invriesbaarheid van cellen tot gevolg. Naar analogie
hiermee hebben we verder onderzocht of zo’n effect ook optreedt bij gevitrificeerde blastocysten die
voortkomen uit eicellen gerijpt met serum of EGF en we hebben hierbij gebruik gemaakt van een
mimetisch peptide om de vitrificatie van de blastocysten te verbeteren (Hoofdstuk 5.2). We zagen
dat vitrificatie leidt tot de opening van de ‘hemichannels’ bij blastocysten die voortkomen uit eicellen
die gerijpt werden in aanwezigheid van serum. Hoewel opening van ‘hemichannels’ gerelateerd werd
aan hogere percentages apoptotische cellen, hebben wij dit effect niet geobserveerd. Interessant
was dat de toevoeging van het mimetisch peptide resulteerde in de sluiting van de ‘hemichannels’
tijdens de vitrificatie, met een verbeterde embryonale ontwikkeling van de gevitrificeerde
blastocysten na rijping in serum tot gevolg. Anderzijds leidde de vitrificaite van blastocysten na
rijping in EGF niet tot de opening van de ‘hemichannels’. Blijkbaar zou EGF de activiteit van de
‘hemichannels’ kunnen beïnvloeden. Verder onderzoek is nodig om dit effect te bevestigen en om de
opening van ‘hemichannels’ onder verschillende omstandigheden te onderzoeken.
Tenslotte worden de belangrijkste resultaten van deze thesis samengevat en bediscussieerd in
Hoofdstuk 6. Het onderzoek was gericht op de optimalisatie van de omstandigheden voor vitrificatie
van rijpe rundereicellen, onrijpe paardeneicellen en runderblastocysten. Onze resultaten tonen
duidelijk aan dat de aanwezigheid van cumuluscellen de vitrificatie van eicellen nadelig beïnvloedde
bij zowel het rund als het paard en dat bij dit effect ook rekening moet gehouden worden met
andere variabelen zoals de concentratie CPAs en de duur van de blootstelling hieraan. Daarom wordt
geadviseerd om de cumuluscellen gedeeltelijk te verwijderen (CR) voor de vitrificatie van rijpe
rundereicellen omdat op die manier de CPAs de eicel kunnen binnendringen, terwijl ook de
bevruchtingscapaciteit behouden blijft. Bij het paard werd de ontwikkeling van blastocysten
bekomen na vitrificatie van onrijpe CRs door korte blootstelling aan hoge concentraties CPAs.
Tenslotte leidde vitrificatie van runderblastocysten na rijping in aanwezigheid van serum tot de
opening van ‘hemichannels’, met een verminderde ontwikkeling tot gevolg. Dit effect kon
tegengegaan worden door gebruik te maken van een mimetisch peptide of door serum te vervangen
door EGF tijdens de eicelrijping.