Bacteriofagen, bacteriële virussen, zijn de meest voorkomende biologische entiteiten op aarde, met een geschat aantal van 1030 partikels. Elke bacteriële cel heeft de mogelijkheid om fagen voort te brengen. Deze virussen gebruiken de
bacteriën om zich te repliceren. Dit proces heeft als gevolg dat de prokaryote gastheer bijna altijd wordt vernietigd. Gebaseerd op de literatuur wordt er in het algemeen gezegd dat fagen elke cel negeert buiten de bacteriële stam waarvoor ze
geëvolueerd zijn om te kunnen infecteren. Dit maakt van hen ideale kandidaten om bacteriële infecties te behandelen, terwijl ze onschadelijk zijn voor niet-target bacteriën en zelfs eukaryote cellen.
Fagen vormen een belangrijk alternatief voor antibiotica. Desalniettemin is het belangrijk of de interactie van fagen met het humaan immuun systeem te evalueren. Daarvoor dienen we zeer zuivere, endotoxine vrije, faagbereidingen te
bekomen. Het verwijderen van deze endotoxines is noodzakelijk omdat ze sterk immunogeen zijn (zoals aangehaald in ) en zouden de geïnduceerde immuun respons kunnen beïnvloeden. Voor deze reden hebben we de endotoxine
verwijderingseffectiviteit van zeven verschillende endotoxine verwijdering strategieën geëvalueerd, beschreven in Deze strategieën omvatten een Endotrap HD kolom zuivering en/of CsCl densiteit centrifugatie in combinatie met Endotrap zuivering, gevolgd door een behandeling met organisch solvent (1- octanol), detergent (Triton X-100) behandeling, enzymatisch inactiveren van het endotoxine door gebruik te maken van alkalisch fosfatase, of een verwijdering van endotoxines door gebruik te maken van CIM monolithische anion uitwisseling
chromatografie, uitgevoerd voor vijf verschillende fagen (i.e. vier P. aeruginosa fagen en één S. aureus faag).
We hebben kunnen aantonen dat CsCl densiteit centrifugatie van P. aeruginosa fagen, met een initiële concentratie van 1012 – 1013 pfu/ml, leidde tot de sterkste reductie in endotoxine concentratie, met een endotoxine verwijderingseffectiviteit van 99.6 %. Additionele zuiveringsmethodes leidde niet tot de volledige
verwijdering van endotoxines uit de faag bereidingen, en leidde slechts tot een extra endotoxine verwijderingseffectiviteit van 23 tot 99 %, dit ging soms gepaard met een sterk verlies in faag concentratie.
Faag biologische studies hebben nood aan hoog zuivere faag partikels in hoge concentraties. Gebruikmakend van de hoog zuivere (CsCl ultra gecentrifugeerde, Endotrap gezuiverde), endotoxine vrije, faag bereidingen, beschreven in , waren we instaat om de immuun respons te bestuderen geïnduceerd door deze fagen.beschrijft een transcriptoom analyse van vers geïsoleerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), geïsoleerd uit één gezonde individu, gestimuleerd voor 20 h met ofwel een P. aeruginosa faag PNM lysaat of zijn bacteriële gastheer P. aeruginosa stam 573. De faag PNM lysaat verhoogde de genexpressie van de genen IL10, IL6, SOCS1, SOCS3, CXCL2, CXCL3 en CXCL6 en verlaagde de
genexpressie van LYZ, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DRB1, HLA-DRB4, CCL17, CCR1, CCR2 en CCR5. Deze resultaten toonde aan dat de P. aeruginosa faag PNM lysaat het potentieel bezit om een immuun respons te induceren.
Verdere analyse in verband met de mogelijkheid van fagen om een immuun respons te induceren werd verkregen door vijf verschillende fagen (een S. aureus faag ISP en vier P. aeruginosa fagen (i.e. PNM, LUZ19, GE-vB_Pae-Kakheti25 en 14-1)) te evalueren, besproken in . Door middel van een specifieke RT-qPCR assay bestudeerden we het genexpressie profiel van perifere bloed mononucleaire cellen,
geïsoleerd uit zes verschillende donoren, voor twaalf immuniteit gerelateerde genen (i.e. CD14, CXCL1, CXCL5, IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL10, LYZ, SOCS3, TGFBI en TNFA). Het werd aangetoond dat fagen in staat zijn om een duidelijke en
reproduceerbare immuun respons te induceren.
Eerst en vooral, de vijf verschillende fagen induceren een vergelijkbare immuun respons, alhoewel alle endotoxines niet volledig verwijderd konden worden uit de P. aeruginosa faag bereidingen. Ten tweede, de geobserveerde immuun respons was hoofdzakelijk anti-inflammatoir, dit werd aangetoond door een vijfvoudige opregulatie van IL1RN, IL10 en SOCS3. Ten derde, er werd aangetoond dat de geobserveerde immuun respons endotoxine onafhankelijk was. Het toevoegen van
endotoxines aan de sterk gezuiverde fagen zorgde er niet voor dat de geobserveerde immuun respons sterker lijkt op die van het (endotoxine bevattende) lysaat, maar bleef gelijkaardig aan dat van het initieel sterk gezuiverde faag preparaat.
Gebruikmakende van de observaties gemaakt gedurende deze studies waren we in staat een hypothetisch model te generen die de uitkomst van een faag therapeutische behandeling kan voorspellen. Dit model is gebaseerd op een eerder
beschreven model van Hodyra-Stefaniak et al. (2015), beschreven in , waarbij we hun model verder hebben uitgebreid om rekening te houden met een anti-inflammatoire faag. Deze aanpassing voorspelt belangrijke gevolgen op de theoretische uitkomst van een faag therapeutische interventie. Ons model toont aan dat, wanneer de fagen anti-inflammatoire eigenschappen hebben, faag therapie succesvol is. Het initiële model van Hodyra-Stefaniak daarentegen toonde een falen
van de faag therapeutische interventie voor het verwijderen van de bacteriële infectie aan.