Project

Prospectie naar het gebruik van gelsoline nanobodies als diagnostisch en therapeutisch instrument in de monogene aandoening familiale amyloidosis van het Finse type (FAF).

Code
178GE0113
Looptijd
01-01-2013 → 31-12-2016
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Onderzoeksdisciplines
  • Natural sciences
    • Systems biology
Trefwoorden
familiale amyloidosis Gelsoline amyloïdose
 
Projectomschrijving

Gelsoline amyloïdose is een slopende, autosomaal, dominant overerfbare, ongeneeselijke ziekte die
veroorzaakt wordt door een punt mutatie - hoofdzakelijk G654A/T - in het GSN gen. Vanwege
deze mutatie verliest het tweede domein van gelsoline een deel van zijn intrinsieke stabiliteit en
neemt een intermediaire conformatie aan tijdens Ca2+ activatie. In deze abberante conformatie
komt een anderzijds begraven furine knipplaats aan het oppervlakte te liggen. Tijdens secretie
colocaliseert mutant plasma gelsoline met furine in het trans-Golgi netwerk. Proteolyse resulteert
in de vorming van een C-terminaal, 68 kDa fragment - C68 - dat op zijn beurt, bij secretie in
de extra cellulaire matrix, verknipt wordt door MT1-MMP like proteasen. Hierbij worden 8 en 5
kDa amyloïdogene fragmenten vrijgesteld die, op termijn, polymerizeren in amyloïd fibrillen die
finaal samenklitten in amyloïd plaques. Patiënten, waarvan de meerderheid terug te vinden is in
Finland, ervaren een triade van oftalmologische, neurologische en dermatologische symptomen.
Momenteel wordt enkel symptomatisch behandeld; oogdruppels, cornea transplantatie en plastische chirurgie. Therapeutica gebaseerd op de inhibitie van furine of MT1-MMP werden reeds
naar voor geschoven. Echter, inhibitie van deze proteasen zal nagenoeg zeker resulteren in ernstige, ongewenste neveneffecten. Op basis hiervan richtten we onze aandacht op mutant plasma
gelsoline. Nanobodies werden ontwikkeld tegen zowel gelsoline en het 8 kDa amyloïdogene fragment. In vitro screening identificeerde één chaperone nanobody voor mutant plasma gelsoline -
Nb11 - en drie voor C68 - FAF Nb1, 2 en 3 - die hun antigen (gedeeltelijk) beschermen tegen
respectievelijk furine en MT1-MMP. Intraperitonale injectie met FAF Nb2 en in vivo expressie
van Nb11 in het AGel muis model resulteerde in beide gevallen in een verminderde afzetting van
het amyloïdogeen 8 kDa fragment. In dit proefschrift werden deze nanobodies verder getest op
hun potentiëel binnen de AGel diagnostiek en therapie.
In een eerste studie werd het potentieel van de FAF nanobodies binnen de amyloïd beeldvorming
verkend. De motivering hiervoor was dat, tot nu toe, de werkzaamheid van potentiële AGel therapeutica enkel kon worden nagegaan via end-stage dierenproeven. Met de reeds gekarakteriseerde FAF Nbs - opgewekt tegen het 8 kDa amyloïdogene gelsoline fragment - op zak namen we het op ons om dit obstakel weg te werken. Gekoppeld aan 99mTc produceerden alle drie de nanobodies scherpe, SPECT/CT beelden van de gelsoline amyloïd afzettingen in AGel muizen. Op basis van zijn superieure signal-to-noise ratio en signaalspecificiteit werd FAF Nb1 gekozen als het meest veelbelovende nanobody. In een follow-up study met AGel muizen die Nb11 expresseren, werd duidelijk dat FAF Nb1 eveneens bruikbaar is voor kwantitatieve beeldvorming. Inderdaad, een
vergelijking van SPECT/CT kwantificatie, biodistributie data en immunofluorescente histologie
resulteerde in gelijkaardige patronen van signaal toename. Daarenboven, correlatieplots toonden
een positief verband aan tussen 99mTc-FAF Nb1 opname en in vivo gelsoline amyloïd afzetting.
In een tweede studie werden de twee types therapeutische chaperone nanobodies - Nb11 die
mutant plasma gelsoline afschermt van furine en FAF Nb1, 2 en 3 die C68 afschermen van
MT1-MMP - samengevoegd in één bispecifiek nanobody. De FAF Nbs werden kop-staart verbonden met Nb11 met behulp van een MT1-MMP gevoelige linker sequentie. De hypothese was
dat, tijdens secretie, het bispecifieke nanobody mutant plasma gelsoline zou binden in het transGolgi netwerk en (gedeeltelijk) behoeden voor furine degradatie. Vervolgens zou, bij secretie
in de extracellulaire matrix, de MT1-MMP gevoelige linker optreden als afleiding en simultaan
instaan voor de vrijstelling van het FAF Nb fragment. Dit laatste zou dan op zijn beurt instaan
voor de afscherming van (de reeds lagere hoeveelheid) C68 tegen MT1-MMP proteolyse. Deze
double hit strategie zou resulteren in een significante reductie van de geproduceerde hoeveelheid 8 kDa peptide. In vitro, gaf een combinatie van Nb11 en FAF Nb1 het beste resultaat.
Gezien deze strategie een intracellulair actieve component bevat, leek adeno-geassocieerd virus
serotype 9 (AAV9) gentherapie een toepasselijke en klinisch relevante toedieningsmethode tijdens
een interventie studie in AGel muizen. FAF Nb1 gebaseerde SPECT/CT beeldvorming en immunohistochemie toonden een significante reductie in de gelsoline amyloïd afzetting aan. Deze
resultaten werden ondersteund door verbeterde spiercontractie parameters.