Project

Formulatie van antigenen in immunomodulerende micropartikels voor kankervaccinatie

Looptijd
01-01-2013 → 31-12-2016
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Medical and health sciences
    • Biomarker discovery and evaluation
    • Drug discovery and development
    • Medicinal products
    • Pharmaceutics
    • Pharmacognosy and phytochemistry
    • Pharmacology
    • Pharmacotherapy
    • Toxicology and toxinology
    • Other pharmaceutical sciences
Trefwoorden
kanker vaccinatie encapsulatie kankercellen antigen formulatie
 
Projectomschrijving

Kanker blijft op dit moment nog steeds één van de grootste doodsoorzaken werelwijd.
Daarnaast is het voorspeld dat de incidentie van mannen en vrouwen die worden
gediagnosticeerd met kanker in hun leven, zal stijgen tot 40 procent. Gelukkig heeft uitgebreid
onderzoek het sterfte percentage drastisch doen dalen door het verbeteren van de huidige
therapieën samen met de opkomst van nieuwe therapeutische strategieën in immunooncologie. Zoals besproken in hoofdstuk 1, is het immuun systeem in staat om infecties te
herkennen en te verwijderen via een slimme en gecombineerde aanval door immuun cellen
van het aangeboren en het verworven immuun systeem. Daarnaast blijkt dat het immuun
systeem een tegenstrijdige rol heeft in de ontwikkeling van kanker aangezien deze zijn gastheer
kan beschermen (immuun-beschermende rol) maar ook kankergroei kan promoten (immuunontwijkende rol).
Deze complexe relatie wordt in detail bediscussieerd in hoofdstuk 2. De strategieën van
immuun-onderdrukking die door de tumor cellen worden toegepast, om herkenning en
eliminatie door het immuun systeem te ontwijken, worden ontrafeld. Daarbij wordt het
duidelijk dat subtiele verschillen in immuun celpopulaties de functie van het immuun systeem
drastisch kunnen beïnvloeden van de immuun-beschermende naar de immuun-ontwijkende
rol. Dit toont het potentieel aan van kanker immunotherapieën om de balans te verschuiven
van een tumor-gunstige naar een tumor-ongunstige omgeving voor kanker cellen via
manipulatie van immuun-onderdrukkende cellen en tumor micro-omgeving.
Deze thesis doelt bij te dragen aan de ontwikkeling van anti-kanker vaccins die gebaseerd zijn
op cel-lysaat, afgeleid van de tumor van de patient. Het potentieel voordeel hiervan, in
vergelijking met de standaard en andere immunotherapeutische strategieën, is het feit dat bij
kanker vaccinatie minder sterke bijwerkingen worden gerapporteerd samen met het feit dat
immunologisch geheugen wordt opgebouwd die een verlengde bescherming kan bieden tegen
uitzaaiingen en herval. Ondanks dat kanker vaccinatie een veelbelovende
immunotherapeutische strategie is in het gevecht tegen kanker en ondanks uitvoerig
onderzoek, heeft dit nog niet de hoge verwachtingen ingevuld. Er is nog steeds een onvervulde
nood aan formulatie strategieën die eenvoudige, milde en efficiënte encapsulatie toelaten van
kanker antigenen in immunogene vaccins.
In hoofdstuk 2, worden de voorwaarden voor het efficiënt targeten and activeren van
dendritische cellen (DCs) in vivo beschreven en wordt de hypothese gesteld dat kanker vaccins
moeten lijken op pathogenen om een sterke anti-tumor respons te kunnen vervoorzaken. Dit
houdt de formulatie in van kanker antigenen in partikels, om opname efficiëntie te verhogen
door DCs, samen met pathogeen- en/of schade-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs
en/of DAMPs), om maturatie van DCs te veroorzaken via de stimulatie van receptoren die
pathogenen kunnen herkennen. Stimulatie van deze receptoren is essentieel voor het
stimuleren van cytotoxische CD8 T-cellen die tumor cellen specifiek kunnen herkennen en
vervolgens elimineren. Daarnaast is er nog een belangrijk probleem in het maken van vaccins
namelijk het ontbreken van effectiviteit en de lage toepasbaarheid van vele van de huidige
strategieën. Dit kan worden toegewezen aan het gebruik van een enkel of meerdere tumorgeassocieerde antigenen die gelimiteerd zijn in gebruik omwille van twee redenen: [1] bij vele
types kanker zijn er nog steeds geen antigenen geïdentificeerd; en [2] omdat deze antigenen
hogere kans hebben op het mislukken van de behandeling wegens mutatie of het ontbreken
van expressie van het antigen door de tumor. Persoonlijke kanker vaccinatie kan deze limitatie
omzeilen omdat het immuun systeem niet enkel wordt geactiveerd tegen tumor-geassocieerde
antigenen maar ook tegen tumor-specifieke antigenen van de patiënt zelf waardoor dit
potentieel kan leiden tot een potente immuunrespons die uniek is voor de patiënt. Noteer
hierbij dat persoonlijke kanker vaccins antigenen bevatten die worden opgezuiverd van
kankerweefsel van de patient en er voldoende hoeveelheid kankerweefsel nodig is waardoor
dit enkel kan toegepast worden bij vaste tumoren die chirurgisch kunnen worden verwijderd.
Enerzijds, houden neo-antigen of nieuw-antigen vaccins individuele tumor-specifieke
antigenen in die worden bepaald via genoom-analyse wat bijzonder duur, arbeidsintensief en
complex is. Vaccins die anderzijds volwaardige kanker cellen bevatten of kanker cel-lysaat van
de patiënt, kunnen hierbij een belangrijk voordeel bieden qua kost en werklast.
Figuur 1. Overzicht van de formulatie strategieën die ontwikkeld zijn in deze thesis, opgedeeld in twee
cel-lysaat-gebaseerde vaccins (groen) en twee intacte cel-gebaseerde vaccins (blauw).
Hierop gebaseerd, werden in deze thesis vier verschillende strategieën ontwikkeld die het
mogelijk maken om vaccins te maken, afgeleid van de kankercellen van de patient. Een
overzicht van deze strategieën wordt geïllustreerd in Figuur 1. Hoofdstuk 3 en hoofdstuk 4
behandelen de formulatie van oplosbare kanker cellysaten terwijl hoofdstuk 5 en hoofdstuk 6
focussen op de formulatie van volledige kankercellen in micropartikels. Deze laatste bevatten
daardoor additioneel componenten van het membraan van cellen en, in geval van volledig
tumorweefsel, proteïnen afkomstig van tumor stroma.
Samengevat, werd in dit werk zeer uitgebreid de focus gelegd op het verkrijgen van
eenvoudige, efficiënte en potente vaccin formulatie strategieën, bestaande uit antigenen
afgeleid van kankercellen, in partikels die lijken op pathogenen wat betreft grootte en
immunogeniciteit. Deze laatste werd verkregen door introductie van TLR-agonisten (PAMPs) of
door immunogene voorbehandeling van de cellen met het oog op heat shock proteïne (DAMPs)
epxressie.

Hoofdstuk 3 houdt het design in van polymeer-proteïne conjugaten gevormd door uitwisseling
van disulfiden. Dit concept werd gebaseerd op drie attractieve eigenschappen: [1] disulfiden
kunnen direct worden gevormd met antigenen via reactie met vrije thiolen op de cysteïneresidu’s; [2] disulfiden zijn stabiel in extracellulaire condities maar worden gereduceerd tot vrije
thiolen in het cytoplasma van cellen; en [3] disulfide-uitwisseling. Hiervoor werd een copolymeer gesynthetiseerd bestaande uit HPMA en APMA (poly(HPMA-APMA)) die
pyridyldisulfide groepen bevat (wordt verder beschreven als poly(HPMA-PDS)) gevolgd door
het bepalen van conjugatie-efficiëntie van het polymeer met een voorbeeld-antigen. Het werd
bevonden dat poly(HPMA-PDS) geschikt is voor efficiënte reversiebele conjugatie van
ovabumine (OVA), op voorwaarde dat het proteïne werd gemodificeerd met beschermde thiolgroepen. In vitro analyse toonde aan dat de polymer-proteïne conjugaten verhoogde opname
vertoonden, in vergelijking met niet-geconjugeerd proteïnen. Dit kan worden toegewezen aan
disulfide uitwisseling van resterende pyridyldisulfide groepen en thiolen die aanwezig zijn op
het oppervlak van cellen. Daarbijkomend, werd er aangetoond dat de formulatie leidde tot
verhoogde antigen-presentatie door DCs, afgeleid van beenmerg, aan CD8+ T-cellen in vitro.
Na karakterisatie van de formulatie met het voorbeeld-antigen OVA werden er verschillende
pogingen gedaan om kanker cel-lysaat te conjugeren, die echter faalden. Het was namelijk niet
mogelijk om beschermde thiol groepen te introduceren op de kanker cel-lysaat proteïnen
wegens problemen met aggregatie. Desondanks heeft deze formulatie strategie potentieel als
platform voor het aanmaken van vaccins die tumor-geassocieerde antigenen of neo-antigenen
bevatten. Daarom zou het interessant kunnen zijn om tumor-geassocieerde antigenen of neoantigenen te conjugeren met poly(HPMA-PDS) samen met verdere optimalisatie van de
formulatie aangaande de hoeveelheid geïntroduceerde beschermde thiolen. In detail wordt
hiermee het verlagen van het percentage aan geïntroduceerde beschermde thiolen op de
kanker antigenen samen met het verhogen van de hoeveelheid pyridyldisulfide groepen op het
polymeer beoogd. Dit met het doel om gelijkende conjugatie efficiënties te bekomen met een
minimaal risico op verlies van epitopen. Daarnaast, kan het effect van de polymeer-conjugatie
op het lymfatisch transport van het antigen worden bestudeerd net als conugatie met
moleculaire adjuvantia, zoals TLR-agonisten in de toekomst.
Aangezien deze thesis doelt op de ontwikkeling van kanker vaccins die materiaal van kanker
cellen bevatten van de patient, wordt er in hoofdstuk 4 een alternatieve strategie voorgesteld
om kanker cel-lysaat te encapsuleren, zonder verdere functionalisatie en dus met vermijden
van verlies van epitopen en aggregatie problemen. Hiervoor werden poreuze calcium
carbonaat (CaCO3) micropartikels onderzocht d.m.v. een 1-staps precipitatie reactie in de
aanwezigheid van kanker cel-lysaat. CaCO3 microparticles werden aangehaald wegens hun
interessante eigenschappen zoals het veelzijdig gebruik ervan voor eiwit-encapsulatie, de hoge
ladingscapaciteit voor macromoleculen, het gebruiksgemak en de lage kost. Daarnaast, kan de
synthese worden uitgevoerd in zeer milde omstandigheden in waterig medium zonder gebruik
van organische solventen, reactieve chemie of hoge energie toevoer. Deze aanpak resulteerde
in efficiënte encapsulatie van kanker cel-lysaat in niet-geaggregeerde sferische CaCO3
microparticles die sterk verhoogde opname efficiëntie vertoonden samen met verbeterde
cross-presentatie door DCs in vitro, in tegenstelling tot opgelost kanker cel-lysaat. Om het
potentieel te verhogen van de CaCO3microparticles als vaccins, werd een toll-like receptor-7/8
agonist CL264, geconjugeerd met poly(HPMA-APMA) (verder vermeld als CL264-poly(HPMAAPMA)), geïntroduceerd via adsorptie op het oppervlak van de micropartikels. Het
introduceren van immunogeniciteit is essentieel voor het efficiënt induceren van een robuuste
anti-tumor immuunrespons via het induceren van DC-maturatie d.m.v. TLR-activatie. TLR7/8
triggering is in het bijzonder interessant in de context van tumor vaccinatie omdat dit leidt tot
verhoogde concentraties van type I IFN en IL-12, die TH1- en cytotoxische T-cell responsen
promoten die nodig zijn voor potente anti-tumor immuniteit. Het TLR7/8-ligand werd
geconjugeerd met een polymeer aangezien het reeds werd aangetoond dat lipide-, polymeer,
en nanopartikel-conjugatie van TLR-liganden zeer sterk de systemische inflammatie reduceert.
Dit rendeert in potente responsen gelocaliseerd ter hoogte van de lymfeknopen leidend tot
verhoogde adaptieve immuun responsen gericht tegen de antigenen. In vitro activatie van DCs,
geïsoleerd uit beenmerg, en RAW blue macrofagen toonde aan dat polymeer-conjugatie van
de TLR7/8-agonist de activiteit ervan niet benadeelde. Bovendien was de agonist potenter
wanneer deze was geadsobeerd op het oppervlak van de micropartikels. Dit kan worden
verklaard door de efficiënte opname van micropartikels waardoor de interactie van het TLRligand met zijn receptor werd verhoogd.
Aangaande deze resultaten, blijkt de formulatie van kanker cel-lysaat in immunogene CaCO3
micropartikels veelbelovend als milde en efficiënte strategie om kanker cel-lysaten te
encapsuleren. Verdere optimilisatie kunnen experimenten inhouden die 1 of meerdere TLRagonisteren introduceren, gevolgd door het bepalen van het geïnduceerde cytokine spectrum.
Het encapsuleren van kanker cel-lysaat, includeert echter geen celmembraan proteïnen en
stroma proteïnen, in geval van compleet tumorweefsel. Daarom werd er in dit werk ook focus
gelegd op het formuleren van intacte kanker cellen in vaccins. In hoofdstuk 5, werden levende
kanker cellen gebruikt als basis voor layer-by-layer (LbL) coating van complementair
interagerende componenten, gevolg door hypo-osmose om bio-hybride capsules te bekomen
die kanker cel-lysaat bevatten in de holle ruimte van de partikels. De LbL techniek die wordt
gebruikt om een synthetisch halfdoorlatend membraan aan te maken op niet-planaire
substraten, is een attractieve techniek omdat het eenvoudige, milde encapsulatie toelaat van
een brede waaier aan componenten in waterig medium. Initiële experimenten werden
uitgevoerd gebruik makend van tegengesteld geladen polyelektrolieten, poly-L-arginine
(PLARG) en dextraan sulfaat (DEXS). Dit is gebaseerd op eerder onderzoek die resulteerde in
biocompatibele, in vitro en in vivo degradeerbare en meerlagige capsules bestaande uit deze
polyelektrolieten die brede cellulaire en humorale immuun responsen induceerden tegen het
geëncapsuleerde antigen. Deze aanpak resulteerde echter in onmiddellijke aggregatie, cellyse
en celdood van de levende kanker cellen tijdens incubatie met PLARG. Daarom werden minder
sterke complementair interagerende componenten geselecteerd om de kanker cellen te
coaten. Deze strategie werd gebaseerd op het gebruik van poly(vinylpyrrolidone) (PVP) en
tanninezuur (TA) die waterstofbruggen vormen. Aangezien het doel van deze thesis de
encapsulatie van volledige kanker cellen inhoudt, is het belangrijk om de intergriteit van de
cellen zoveel als mogelijk te behouden tijdens de coating. In dit opzicht, werd er bijzondere
aandacht geschonken aan het bepalen van de optimale coating componenten en condities. Er
werd bevestigd dat, na lyse door hypo-osmose, de kankercellen dood waren wat belangrijk is
om hergroei van nieuwe tumoren te vermijden na vaccinatie o.w.v. residuele levende cellen.
Dit laatste is vaak het geval in de huidige vaccins van volledige kanker cellysaten. Immunogene
eigenschappen werden geïntroduceerd in de capsules, via een proof of concept studie, door
het voorbehandelen van de kanker cellen met warmte (heat shock) om expressie van DAMPs,
belangrijke endogene immuun activators, te induceren.
Om het potentieel te bepalen van de bio-hybride cel-gebaseerde capsules, werden preliminaire
in vitro opname experimenten uitgevoerd, waaruit bleek dat slechts 5 % van de partikels
worden opgenomen. We wijzen dit toe aan de omvang van de partikels die te groot zijn om
efficiënte opname te induceren door dendritische cellen (boven 10 µm). Verschillende
pogingen werden uitgevoerd om efficiënte opname door immuun cellen mogelijk te maken.
Hiervoor werden de capsules blootgesteld aan zout of hoge temperaturen met het oog op het
krimpen van de partikels. Dit resulteerde echter in degradatie of aggregatie van de partikels
Aangezien het niet mogelijk bleek te zijn om efficiënte opname te verkrijgen met de LbLgecoate kanker cellen, werd een alternatieve strategie ontwikkeld in hoofdstuk 6 voor het
formuleren van kanker cellen in vaccin partikels via een één-staps methode. Deze is aanzienlijk
minder arbeidsintensief en tijdsrovend en vermijdt bijgevolg onnodig verlies van cellen in
tegenstelling tot de layer-by-layer coating van kanker cellen. Dit heeft geleid tot een
eenvoudige, maar efficiënte methode om kanker cellen in hun geheel te encapsuleren in
polyelektroliet micropartikels via sproeidrogen. Poreuze, niet-geaggregeerde polyelektrolietomhulde micropartikels, die dode kanker cellen bevatten, werden bekomen via het mengen
van mannitol met levende kanker cellen samen met de tegengesteld geladen polyelektrolieten,
PLARG en DEXS in waterig medium net voor het sproeidrogen. Net zoals de bio-hybride capsules
(hoofdstuk 5), bevatten de polyelektroliet-omhulde micropartikels enkel dode kanker cellen
wat hergroei van tumoren na vaccinatie kan vermijden. De polyelektroliet-omhulde kanker
cellen waren stabiel als micropartikels, na resuspensie in PBS buffer, en stelden geen proteïnen
vrij in het supernatans. In vitro evaluatie toonde aan dat de micropartikels veel meer werden
opgenomen door dendritische cellen en significant de cross-presentatie van antigenen
verhoogden, ten op zichte van cel-lysaat. Analoog met de kanker cel-lysaat-bevattende CaCO3
micropartikels, beschreven in hoofdstuk 4, werden immuun-stimulerende eigenschappen
geïntrodudeerd via het sproeidrogen van de vaccin componenten in aanwezigheid van
CL264-poly(HPMA-APMA). Dit resulteerde in immunogene micropartikels die sterk
TLR-activatie induceerden.
Deze resultaten tonen het potentieel aan van de polyelektroliet-omhulde kanker cellen als
immunogene antigen vaccins. Introductie van meerdere TLR-liganden gevolgd door het
bepaling van de optimale condities voor T-cel activatie, zoals ook voorgesteld voor de lysaatbevattende CaCO3 micropartikels, zou daarom een interessant vervolg kunnen zijn om het
potentieel van deze formulatie te verhogen. Daarnaast, kan immunogene behandeling of
inductie van immunogene celdood van de kankercellen, voor het sproeidrogen, ook een
meerwaarde betekenen in het verhogen van het potentieel van de formulatie in activatie van
DCs en CTL-gedreven anti-tumor responsen.
In conclusie, aangaande de cel-lysaat-gebaseerde vaccins, bleken de CaCO3 polymeer
micropartikels meer veelbelovend dan de polymeer-proteïne geligeerde nano-conjugaten qua
toepasbaarheid. CaCO3 micropartikels laten namelijk toe om cel-lysaat efficiënt te
encapsuleren, zonder functionalisatie ervan, in immunogene partikels die efficiënt dendritische
cellen activeren in vitro. Voor de cel-gebaseerde vaccins, aan de andere kant, werd aangetoond
dat de polyelektroliet-omhulde kanker cellen superieur zijn vergeleken met de bio-hybride celgebaseerde partikels. Deze methode maakt het mogelijk om kanker cellen via één stap te
formuleren in polyelektroliet partikels die veelbelovende resultaten vertoonden in vitro
aangaande opname efficiëntie, MHC-I kruispresentatie inductie en immunogeniciteit.
Wat betreft toekomstige experimenten, zou het interessant kunnen zijn om het potentieel te
beoordelen van deze twee veelbelovende vaccins in vivo, via het bepalen van de inductie van
anti-tumor immuniteit. De initiële in vivo experimenten kunnen worden uitgevoerd gebruik
makende van een immunogene kanker muis cellijn die OVA stabiel tot expressie brengt om
grondige screening toe te laten met verkrijgbare assays. Daarnaast, zou het bijzonder
interessant zijn om de meest veelbelovende formulatie in vivo te vergelijken met het zelfde
vaccin dat neo-antigenen bevat.
In het algemeen heeft deze thesis vier verschillende strategieën onderzocht om kanker cellysaat of kanker cellen te encapsuleren in immunogene en gepersonaliseerde vaccin partikels.
Deze thesis toonde het gunstige effect aan van antigen formulatie in partikels, lijkend op
pathogenen, die immuun-stimulerende componenten bevatten (in dit geval TLR-agonisten)
met betrekking tot antigen opname en activatie van dendritische cellen.