Bestrijding van Mycobacterium tuberculosis-infectie met celwanddegraderende enzymen

Tuberculose (TB) wordt veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Deze bacterie wordt vaak “de meest succesvolle ziekteverwekker ter wereld” genoemd en met een reden: in de geschiedenis van de mensheid heeft TB meer mensen gedood
dan eender welke andere infectieziekte, met meer dan een miljard doden alleen al in de laatste 200 jaar. Door verbeterde levensomstandigheden en de ontdekking van conventionele antibiotica en het Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (M. bovis BCG) vaccin is de mortaliteit van TB doorheen de twintigste eeuw gestaag afgenomen. Mensen in geïndustrialiseerde landen zien het dan ook vaak als een ‘ziekte van vroeger’. TB blijft echter de dodelijkste infectieziekte wereldwijd en meervoudige resistentie tegen de gekende antibiotica neemt toe – een globale bedreiging van de volksgezondheid. Wereldwijd is het succes van de behandeling van multi-drugresistente TB (MDR-TB) slechts 55% en de breed-spectrum antibiotica die ervoor gebruikt worden zijn erg toxisch en brengen zware bijwerkingen met zich mee. Er is de laatste jaren vooruitgang gemaakt in de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, en van patiëntgroepen die behandeld werden met nieuwe gecombineerde antibioticakuren die bijvoorbeeld bedaquilline en delamanid bevatten, overleefde ruim 80%, een grote verbetering. Toch blijft de zoektocht naar nóg effectievere en sneller werkende medicijnen een grote uitdaging.

De uitdaging in de ontwikkeling van nieuwe TB-medicijnen ligt vooral in de eigenschappen van Mtb. De bacterie groeit zeer traag, kan intracellulair in macrofaagfagosomen repliceren en heeft een relatief ondoordringbare, complexe gelaagde celwandstructuur. Deze mycobacteriële celwand is een fysieke barrière die penetratie van antimycobacteriële middelen benadeelt zodat die hun therapeutisch potentieel niet kunnen waarmaken. De natuur biedt ons echter middelen die kunnen helpen om tot de celwand door te dringen: in de loop van de evolutie zijn er gespecialiseerde mycobacteriofagen ontstaan die mycobacteriën kunnen infecteren. Zij produceren celwanddegraderende enzymen (zoals endolysine en LysB) die elk een laag van de mycobacteriële celwand breken. Zulke enzymen bieden een immens potentieel voor therapeutisch gebruik. Enzymen afgeleid van fagen worden nu dan ook al gebruikt tegen enkele infectieziekten, en er zijn er nog veel meer in ontwikkeling. Onze hypothese is dat we verschillende van dit soort celwanddegraderende enzymen tegelijk kunnen toedienen, zodat ze mogelijks synergetisch werken en de celwand laag-voor-laag ‘afpellen’ of beschadigen. Dit zou de bacillen kunnen doden, of de celwand voldoende doorlaatbaar kunnen maken om het effect van conventionele antbiotica te kunnen versnellen. Daarom hebben we in dit project de synergetische activiteit van celwanddegraderende enzymen en biofarmaceutisch acceptabele surfactanten verkend en zijn we op zoek gegaan naar een manier om dit soort eiwit-gebaseerde medicijnen gericht naar de intracellulair replicerende Mtb te krijgen.

We onderzochten de recombinante productie en zuivering van endolysine en LysB van mycobacteriofagen Ms6 en D29. In parallel hebben we een assay geoptimaliseerd waarmee we in kleine volumes snel veel verschillende antimycobacteriële middelen kunnen screenen. Door een bioluminescentie-reporter die beschreven is voor gebruik in virulente Mtb-stammen toe te passen in een auxotrofe Mtb-stam, konden we een betrouwbaar assay opzetten in een lab van bioveiligheidsniveau 2. Met dit assay hebben we de groei-inhiberende activiteit van verschillende celwanddegraderende enzymen onderzocht, alleen en in combinatie, en in aan- en afwezigheid van surfactant (polysorbaat-80). We hebben ontdekt dat verschillende enzymen, zoals LysB afgeleid van mycobacteriofagen, maar ook humaan lysozyme en kippeneiwitlysozyme, inderdaad de mycobacteriële groei konden verhinderen, vermoedelijk door de (mycolylarabinogalactaan- en peptidoglycaan-)celwandlagen te breken. Fungaal α-amylase (een α-glucaanbreker) had echter geen effect. Een interessante observatie was dat de meeste van deze enzymen een biofarmaceutisch acceptabele concentratie van surfactant nodig hadden om hun antimycobacteriële functie uit te kunnen voeren. De combinatie van LysB van mycobacteriofaag Ms6 (LysB-Ms6) met fungaal α-amylase en polysorbaat-80 was uitzonderlijk sterk, met een synergetisch effect. Terwijl we dit project afrondden lieten andere onderzoekers in het modelorganisme Mycobacterium smegmatis zien dat de toevoeging van een celwanddegraderend enzym inderdaad tot de versnelling van het antimycobacteriële effect van conventionele antibiotica leidt. Dit is een waardevolle aanvulling op onze resultaten die tegelijk een duidelijk perspectief biedt voor verdere experimenten met ons screening assay voor antimycobacteriële middelen.

Alles samengenomen heeft dit project bijgedragen aan de kennis over het gebruik van glycogemodificeerde eiwitten en enzymen om aandoeningen zoals TB te bestrijden. Na verdere ontwikkeling zien we het gebruik van antimycobacteriële enzymen als laatste klinisch middel om conventionele antibiotica te complementeren in de behandeling van actieve multidrugresistente of extensief-drugresistente Mycobacterium-infecties. Om huidletsels door Buruli-ulcers en lepra te behandelen, zouden de enzymen topicaal aangebracht kunnen worden, terwijl actieve longinfecties met MDR-TB bestreden zouden kunnen worden met een kort behandelingsregime dat enkele respiratoire toedieningen van controlled-release enzym bevat. Hiermee hopen we patiënten te kunnen helpen die nu niet voor adequate behandeling in aanmerking komen.