Project

Studie van de antivirale functie van Mx eiwitten tegen influenza

Looptijd
01-01-2014 → 31-12-2017
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Medical and health sciences
    • Infectious diseases
    • Virology
Trefwoorden
Mx eiwitten Griep
 
Projectomschrijving

Influenza of de griep is een ziekte die wordt veroorzaakt door een infectie met het influenza virus en ze wordt gekenmerkt door symptomen als koorts, hoesten, hoofdpijn, pijnlijke
spieren en gewrichten, algehele malaise, keelpijn en een loopneus. Meestal is men binnen een week na de eerste symptomen hersteld. Toch veroorzaken influenza virussen jaarlijks drie tot vijf miljoen ernstige gevallen van ziekte en leiden ze tot ongeveer 250 000 tot 500 000 sterfgevallen wereldwijd. Vooral kinderen, ouderen, en personen met
onderliggende aandoeningen of andere infecties zijn zeer gevoelig voor infecties met het influenza virus1. Het influenza virus wordt makkelijk overgedragen van mens tot mens,
zowel via rechtstreeks contact als via de lucht. Dit laatste is vooral belangrijk in drukke omgevingen, want door niezen en hoesten worden er kleine druppeltjes gevormd die het
virus bevatten. Deze druppeltjes worden makkelijk verspreid naar personen in de nabije omgeving, die deze dan op hun beurt inademen. Hierna kunnen de influenza virussen
epitheelcellen infecteren in de luchtwegen. Wanneer het virus de cellen is binnengedrongen, zal het zijn genetisch materiaal vrijstellen in het cytoplasma onder de vorm van virale ribonucleoproteïnen (vRNP’s) die vervolgens de celkern binnengaan. In de celkern vindt de transcriptie en de replicatie plaats. Transcriptie leidt tot de productie van
mRNA en dit mRNA wordt vervolgens naar het cytosol gebracht waar het vertaald wordt tot virale eiwitten. Sommige van deze virale eiwitten gaan naar de celkern waar ze de replicatie van het virale genoom opstarten. Replicatie leidt tot de productie van nieuwe virale RNA moleculen die aanleiding geven tot de vorming van nieuwe vRNP’s. Deze vRNP’s verlaten
vervolgens de celkern en vormen nieuwe viruspartikels samen met structurele virale eiwitten. De nieuwe virussen komen vrij uit de geïnfecteerde cel en kunnen de naburige
cellen infecteren, waardoor de hele cyclus van voor af aan begint2.
Meer dan 50 jaar geleden ontdekten Lindenmann et al. een gen dat ervoor zorgt dat muizen resistent zijn tegen infectie door het influenza A virus (FLUAV). Dit gen werd Mx1
genoemd3-5, wat staat voor myxovirus resistance 1. Deze naam werd gegeven omdat muizen die een functionele vorm van het eiwit aanmaken resistent zijn tegen infecties door FLUAV en andere myxovirussen4,5. Een tijd later werd een humane ortholoog van muis Mx1 geïsoleerd, en dit gen werd MxA genoemd6. Tot nu toe zijn er verschillende Mx orthologen
beschreven in zo goed als alle vertebraten. Deze orthologen verlenen resistentie tegen een hele resem aan virussen zoals Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae, en Bunyaviridae7. Het
exacte mechanisme waarmee muis Mx1 virussen onderdrukt, is nog steeds grotendeels onbekend. Onze onderzoeksgroep heeft bijgedragen aan de ontrafeling van het specifieke
anti-influenza mechanisme door aan te tonen dat Mx1 een interactie aangaat met het nucleoproteïne (NP) en het polymerase basisch (PB2) eiwit van FLUAV, en dat in de aanwezigheid van muis Mx1 de interactie tussen deze twee eiwitten wordt verhinderd8. We hebben ook bewijzen gevonden dat het Mx1 eiwit reeds gevormde influenza A vRNP’s actief
zou kunnen verbreken9. Aangezien Mx1 een type I interferon-induceerbaar eiwit is, vermoedt men dat het voornamelijk vroeg na de infectie FLUAV onderdrukt en het virus op deze manier verhindert zich in de luchtwegen te verspreiden. Het is niet bekend of Mx1 een rol kan spelen in het immuun cel compartiment na een infectie door FLUAV. De inductie van
een antivirale status, door type I interferon, in antigenpresenterende cellen of geheugen T cellen heeft een direct effect op het immuunsysteem tegen respectievelijk primaire of secundaire influenza virus infecties10,11. Daarenboven kunnen humane dendritische cellen
MxA snel opreguleren en waardoor ze, tenminste in vitro, resistent worden tegen het virus en de antigenpresentatie in stand kunnen houden12. De meeste studies die het
immuunantwoord opgewekt door FLUAV bestuderen maken gebruik van muisstammen die geen functionele vorm van Mx1 kunnen produceren13. Op basis van deze studies wordt
beweerd dat bepaalde types immuuncellen zoals CD103+ dendritische cellen en long residente geheugen CD8+ T cellen, beschermd zijn tegen FLUAV infecties doordat ze een
interferon-geïnduceerde antivirale status aannemen10,11. Hierdoor is de hypothese ontstaan dat Mx1 ook een rol zou kunnen spelen in het vormen van de antivirale status in deze
cellen.
Om deze hypothese te onderzoeken, hebben we een infectiemodel opgezet waarin we gebruik maakten van beenmergchimeren. Aangezien de meerderheid van de
immuunceltypes voortkomen uit het beenmerg, zal een beenmergtransplantatie van muizen met een functioneel Mx1 gen (B6.A2G Mx1+/+) naar muizen zonder een functioneel
Mx1 gen (B6.A2G Mx1-/- ) en vice versa, ons toelaten om de eventuele functie van Mx1 te bestuderen in celtypes die afkomstig zijn uit het beenmerg. De chimere muizen werden
geïnfecteerd met een hoge dosis FLUAV en meerdere parameters werden onderzocht (lichaamsgewicht, virale titers in de long, virale mRNA- en eiwitniveaus in de long). Hieruit
konden we afleiden dat Mx1-expressie in celtypes afkomstig uit het beenmerg niet de voornaamste factor was die de resistentie tegen een FLUAV infectie bepaalde. De drijvende
kracht achter de resistentie tegen FLUAV infecties was de aanwezigheid van Mx1 in stromale cellen. Dit verschil tussen Mx1-/- en Mx1+/+ recipiënt muizen was ook merkbaar bij
de verandering van de hoeveelheden eosinofielen, monocytafgeleide dendritische cellen en alveolaire macrofagen in de long.
De reeds bekomen resultaten boden echter geen sluitend bewijs om onze hypothese te bevestigen. Daarom hebben we een tweede infectiemodel opgezet met het Thogoto virus
(THOV), een virus dat wordt overgedragen door teken. THOV is, net als FLUAV, een lid van de familie van de Orthomyxovirussen. Bovendien zijn kleine knaagdieren zoals muizen en ratten de natuurlijke gastheren van dit virus en is THOV ook gevoelig voor inhibitie door Mx114,15. Chimere muizen werden geïnfecteerd met een hoge dosis THOV en wederom werden meerdere parameters onderzocht (lichaamsgewicht, virale titers in de lever, virale
eiwitniveaus in de lever, leverpathologie). Net als bij het FLUAV infectiemodel is Mx1- expressie in de stromale cellen de belangrijkste determinant voor resistentie tegen infectie.
Toch vertoonden bestraalde Mx1-/- recipiënt muizen die Mx1+/+ beenmergcellen ontvingen een gereduceerde morbiditeit na THOV infectie in vergelijking met Mx1-/- recipiënt muizen die Mx1-/- beenmergcellen ontvingen. Dit uitte zich in minder verlies van lichaamsgewicht en minder ernstige leverpathologie bij deze groep muizen. Deze observatie toont aan dat Mx1 een belangrijke rol kan spelen in immuunceltypes na een virale infectie, hoewel het belang van deze rol sterk afhankelijk is van het infecterende virus.
Als tweede luik van deze thesis hebben we onderzocht wat de bijdrage van Mx1 kan zijn in de context van een vaccinatie met een influenza A NP antigen dat door middel van een
virale vector wordt toegediend. Altenburg et al. hebben recentelijk onderzocht of recombinante gemodificeerde vaccinia Ankara (rMVA) vaccins die gemuteerde vormen van
het FLUAV NP eiwit aanmaken, een sterkere antigenspecifieke immuunrespons zouden opwekken dan rMVA vaccins die de wild type (WT) vorm van NP aanmaken (rMVA-NPwt).
De aangebrachte mutaties waren bedoeld om de NP moleculen in het cytosol te houden of om hun afbraak tot peptiden te verbeteren. Hiervoor werd het nucleair lokalisatiesignaal (NLS) van NP gemuteerd (rMVA-NPmut) of volledig verwijderd (rMVA-NPΔNLS), of werd
ubiquitine aan NP gekoppeld (rMVA-UbqNP). De gemuteerde NP constructen konden in vitro NP-specifieke T cellen beter activeren dan het rMVA-NPwt construct. Dit effect kon
echter niet doorgetrokken worden naar een in vivo situatie, want vaccinatie van C57BL/6 muizen met de verschillende rMVA-NP constructen leidde niet tot een significant verhoogde
NP-specifieke CD8+ T cel respons of een betere bescherming tegen een FLUAV infectie dan het geval was voor het rMVA-NPwt construct16. Dit resultaat komt waarschijnlijk voort uit
het feit dat het rMVA-NPwt construct gemakkelijk de vereiste drempelwaarde voor NPantigen kan bereiken en dus moeilijk verbeterd kan worden door deze variante NP constructen. Deze drempelwaarde voor NP-antigen moet bereikt worden om een robuuste CD8+ T cel respons te kunnen ontwikkelen. Daarom vermoedden wij dat muizen die een model zouden zijn dan C57BL/6 muizen, die geen functioneel Mx1 eiwit aanmaken13, om deze verschillende rMVA-NP constructen te testen. Mx1, waarvan is aangetoond dat het een interactie aangaat met NP8, kan optreden als de extra restrictiefactor die nodig is om het voordeel van de gemuteerde NP constructen aan te tonen.
Daarom werden B6.A2G Mx1-/- en B6.A2G Mx1+/+ muizen gevaccineerd met de verschillende rMVA-NP constructen. Een week na de tweede vaccinatie werd de NPspecifieke CD8+ T cel respons onderzocht in bloed en milt door middel van intracellular cytokine staining (ICS) en enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT). Zowel de resultaten
bekomen met ICS als met ELISPOT vertoonden geen significante verschillen tussen de gemuteerde constructen en het WT NP construct in B6.A2G Mx1+/+ muizen. Desalniettemin vertoonden de ELISPOT resultaten wel de trend dat rMVA-NPmut en rMVA-NPΔNLS constructen een sterkere CD8+ T cel respons opwekken dan het rMVA-NPwt construct.
Maar om de theorie dat Mx1 een belangrijke factor zou kunnen zijn in de inductie van een NP-specifieke cellulaire respons na vaccinatie met gemuteerde NP constructen zijn er
bijkomende experimenten nodig.
De resultaten die we bekomen hebben met het THOV infectiemodel tonen duidelijk aan dat Mx1 na virale infectie een belangrijke rol speelt in immuuncellen. Bijgevolg konden we twee grote conclusies trekken uit deze thesis. Ten eerste is het bij het bestuderen van een infectiemodel is het van groot belang om een gepaste combinatie van gastheer en virus te
gebruiken. Aangezien THOV een natuurlijke pathogeen is voor kleine knaagdieren, is dit virus ideaal om te gebruiken in een muismodel. Ten tweede is het tropisme van het
geselecteerde virus is ook zeer belangrijk. Bij het onderzoeken van de antivirale rol van een eiwit in een bepaald celtype is het essentieel dat het gebruikte virus dit celtype ook effectief
kan infecteren. THOV infecteert myeloïde CD11b+ cellen17, en bleek dus uitermate geschikt voor deze experimenten.