Project

Volgen van de wijzigingen in het histon-modificatiepatroon met niet-gerichte massaspectrometrie

Looptijd
01-10-2014 → 10-01-2019
Financiering
Gewestelijke en gemeenschapsmiddelen: IWT/VLAIO
Mandaathouder
Onderzoeksdisciplines
  • Natural sciences
    • Cell growth and development
    • Epigenetics
    • Posttranslational modifications
Trefwoorden
massaspectrometrie Epigenetica histonen PTM Embryonale stamcellen SWATH-MS
 
Projectomschrijving

Dit proefschrift beschrijft zowel de biologische als technische aspecten van één specifiek epigenetisch model: histonen en hun modificaties.

In dit proefschrift bestuderen we het histone-epigenoom van humane embryonale stamcellen (hESCs) tijdens de conversie van de primed naar de naïeve toestand met behulp van niet-gerichte massaspectrometrie (MS). In totaal zijn 23 histon post-translationele modificaties (hPTM's) in de loop van de tijd aanzienlijk veranderd. H3K27me3 was de meest opvallende stijgende marker-hPTM in naïeve hESCs. Dit is in lijn met wat recent werd beschreven in muis, wat ons er toe heeft aangezet om alle gemene hPTM-veranderingen tussen muis en mens te vergelijken. Dit vergelijk onthulde een set geconserveerde hPTM-markers voor de naïeve toestand. In principe presenteren we de eerste landkaart van het veranderende menselijke histone-epigenoom tijdens de conversie van hESCs van de primed naar de naïeve toestand. Dit onthulde verder overeenkomsten met muis, die wijzen op een geconserveerde epigenetische signatuur van zoogdieren in de grondtoestand van pluripotentie.

'Sequential window acquisition of all theoretical fragment ion'  (SWATH) -MS heeft een groot potentieel voor grootschalige analyse van hPTMs en hun combinatoriële patronen, omdat het ongerichte nauwkeurige identificatie en kwantificatie van hPTMs mogelijk maakt. In dit proefschrift presenteren we een complete SWATH-workflow die specifiek is aangepast voor de niet-doelgerichte studie van histonen (hSWATH). Meer specifiek werd de workflow geoptimaliseerd om een ​​maximale weergave van de histoncode en een hoge specificiteit voor isobare en co-eluerende peptiden te garanderen. We hebben de validiteit van de workflow beoordeeld op een technische dataset van een time-lapse deacetylering van een commercieel histone-extract met behulp van HDAC1, dat een grondwaarheid bevat, d.w.z. geacetyleerde substraatpeptiden verminderen in intensiteit. Ten slotte passen we deze workflow met succes toe in een biologische omgeving en onderzoeken we vervolgens de differentiële respons op HDAC-remming in verschillende borstkankercellijnen.